Спосіб визначення противірусної дії препаратів на основі флуоренів

Спосіб визначення противірусної дії препаратів на основі флуоренів, який характеризується тим, що у рівних кількостях у пробірку вноситься досліджуваний препарат на основі флуоренів певної концентрації і стафілококовий бактеріофаг або інтестифаг, інкубують у термостаті за температури 37 °С 30 хв, наносять краплю на поверхню агару з посівом стафілококової культури та інкубують у термостаті 24 години, далі проводять облік - відсутність зон лізису на місці нанесення краплі свідчить про противірусну дію препарату. (19) (21) u200909825 (22) 28.09.2009 (24) 25.03.2010 (46) 25.03.2010, Бюл.№ 6, 2010 р. (72) КОЦЮМБАС ІГОР ЯРОСЛАВОВИЧ, АВДОСЬЄВА ІРЕНА КОРНЕЛІВНА, ПАВЛІЙ РОСТИСЛАВ БОГДАНОВИЧ, РЕГЕНЧУК ВОЛОДИМИР ВОЛОДИМИРОВИЧ, БАСАРАБ ОЛЕГ БОГДАНОВИЧ, МЕЛЬНИЧУК ІГОР ЛЕОНТІЄВИЧ, СИДОРУК НАДІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА, ЧАЙКОВСЬКА ОЛЕКСАНДРА ІЛЛІВНА (73) ДЕРЖАВНИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ КОНТРОЛЬНИЙ ІНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНИХ ПРЕПАРАТІВ ТА КОРМОВИХ ДОБАВОК 3 первинне вивчення їх антивірусної дії швидким і результативним способом. В основу корисної моделі покладено завдання, розробити новий спосіб (експрес-метод) визначення противірусної дії ветеринарних препаратів на основі флуоренів, який дозволить швидко і результативно виявити противірусну активність нових речовин. Застосування цього способу у визначені противірусної активності нових засобів (нових субстанцій, синтезованих препаратів, фітопрепаратів) сприятиме швидшому впровадженню у ветеринарну медицину нових високоякісних противірусних засобів. Поставлене завдання вирішується тим, що пропонується швидкий (скринінг) спосіб визначення противірусної дії нових препаратів на основі флуоренів шляхом блокування репродукції бактеріофагу чи інтестифагу в клітинах бактеріальної культури. Встановлення противірусної дії препаратів проводиться шляхом внесення досліджуваного препарату певної концентрації до стафілококового бактеріофагу. Пробірки інкубують у термостаті за температури 37 °С - 30 хв. У якості контролю беруть завісину бактеріофагу без препарату. На пластинку м'ясопептонного агару в чашці Петрі засівають 4-х годинну культуру Staphylococcus aureus 209-p. На засіяні і підсушені чашки наносять краплі з пробірок: фат + препарат і фаг без препарату (контроль). Після інкубації посівів проводять візуальну оцінку: наявність лізису бактерій в суміші фаг + препарат і відсутність його у контролі свідчить про противірусну дію досліджуваного препарату. При проведенні патентно-інформаційного пошуку заявником не знайдено відомостей про за 48570 4 стосування способів визначення противірусної дії препаратів на основі флуоренів. Реалізація заявленого технічного рішення здійснюється таким чином: у пробірку вноситься у 3 3 рівних кількостях (наприклад 0,5 см + 0,5 см ) досліджуваний препарат певної концентрації і стафілококовий бактеріофаг або інтестифаг, внаслідок чого утворюється суміш фаг + препарат, яку інкубують у термостаті за температури 37 °С - 30 хв, після чого за допомогою піпетки наносять краплю суміші (фаг + препарат) на поверхню агару з посівом стафілококової культури і інкубують у термостаті 24 години, далі проводять облік - відсутність зон лізису на місці нанесення суміші (фаг + препарат) свідчить про противірусну дію препарату. Стафілококову культуру готують відомим способом: на поверхню агарового м'ясопептонного середовища в чашці Петрі рівномірно засівають чисту 4-х годинну культуру Staphylococcus aureus 209-p, і підсушують. Приклади конкретного використання корисної моделі Приклад 1. З метою встановлення віруліцидної та антифагової дії вітчизняних препаратів на основі флуоренів (F1, F1-9, F1-a), синтезованих на кафедрі фармхімії Львівського національного медичного університету ім. Д.Галицького визначали їх ефективність способом, який заявляється. Результати досліджень віруліцидної дії нових синтезованих вітчизняних препаратів наведені у таблиці. Таблиця № п/п Назва синтезованих препаратів 1. F1 (порошок) 2. F1-9 (порошок) 3. F1-a (порошок) 4. Амінокапронова кислота 5. Контроль-аміксин 6. Контроль - стафілококовий бактеріофаг 7. Контроль-фаг * 0 - «наявність лізису» - від'ємний результата; **+ - «відсутність лізису» - позитивний результат. Встановлено, що сполука F1 (порошок) та амінокапронова кислота проявили віруліцидку дію, тоді як сполуки F1-9 (порошок) та F1-а (порошок) дали від'ємний результат. Приклад 2. З метою перевірки результатів ефективності противірусної дії вітчизняних препаратів на основі флуоренів (F1, F1-9, F1-a) визначених новим способом їх досліджували стандартним способом на живих тест-системах - КЕ (на курячих ембріонах), У дослідженнях використовували вірус хвороб Ньюкасла (ВХН) та вірус грипу птиці (ПГ). Контролем служили курячі ембріони заражені вірусом та інтактні. Ефективність визначали за різницею тит Інтестифаг + 0 0 + + 0 0 Стафілококовий бактеріофаг + 0 0 + + 0 0 ру в досліді та контролі, та за виживанням курячих ембріонів. Встановлено, що при визначенні противірусної дії на КЕ сполука F1 (порошок) проявила виражену вірусостатичну та віруліцидну дії на вірус хвороби Ньюкасла та вірус грипу птиці. Загибель курячих ембріонів від ВХН становила 24 %, а від ПГ - 16 %. Сполука F1- 9 (порошок) слабо проявила противірусну дію, а сполука F1-a (порошок) не проявила противірусної дії до ВХН та ПГ. Приклад 3. Для перевірки результатів ефективності противірусної дії вітчизняних препаратів на основі флуоренів (F1, F1-9, F1-a) визначених новим способом їх досліджували стандартним способом на 5 48570 культурі фібробластів ембріонів курей (ФЕК). Визначення параметрів противірусної дії досліджуваних зразків проводили на культурі клітин за візуальним спостереженням затримки цитопатогенної дії (ЦПД) у модифікації Жиравецького M.I. Противірусну дію досліджуваних зразків визначали згідно стандартної методики за допомогою інвертованого мікроскопу «Біолам П-1» (ЛОМО, Росія). Ступінь зниження ЦПК визначали за 4-х бальною шкалою (сильно виражена, виражена, слабо виражена дія або нема захисного ефекту). Для контролю противірусної дії використовували препарат аміксин. При проведенні досліджень на культурі ФЕК сполуки F1 та F1-9 виявилися не токсичними і не спричиняли деструктивних змін клітинного моношару. Вплив сполуки F1 на репродукцію вірусів ВХН та ПГ була сильно виражена і не відрізнялася від дії аміксину. Проте життєздатність культур ФЕК, інфікованих вірусом ВХН та ПГ слабо захищала сполука F 1 - 9, а сполука F 1 -а не проявила противірусної дії. Специфічність те, ефективність Способу визначення противірусної дії препаратів на основі флуореьів підтверджується результатами отриманими при проведенні досліджень-класичними способами визначення противірусної дії. Комп’ютерна верстка І.Скворцова 6 Джерела інформації: 1. Петрух Л.І. Актуальність створення та впровадження у промислове виробництво нових лікарських засобів (збірник описів винаходів) / за ред Петрух Л.І., Петрух В. М.-Львів, ЛЦНТЕІ, 2003.-198 с. 2. Петрух Л.І. Вклад у розвиток науковотехнологічного парку створення і виробництва нових українських ліків // ІІ-а Міжнародна науковопрактична конференція «Розвиток науковотехнологічних парків та інноваційних структур інших типів: Україна і світовий досвід». - Львів, 23-26 червня 2003.-С.49-55. 3. Реєстр галузевих нововведень. 173/15/01. Флуренізид - новий оригінальний український препарат протитуберкульозної та протимікробної дії /В.М.Борис, Л.І.Петрух, О.А.Ткач. 4. Супозиторії хламіциду - ефективний препарат для лікування генітальних форм хлімідіозу корів /М.В.Косенко, Л.І.Петрух, І.К.Авдосьєва. О.В.Лук'янчук, О.М.Качмар // Науковий вісник Національного аграрного університету.-200.- №22.С. 35-36. 5. Жиравецкий М.И. Микрометод скрининга и изучение антивирусной активности химических соединений в культуре клеток. Вирусы человека и животных. Рига, 1984.-С. 72. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601