Спосіб визначення чутливості цитомегаловірусів до противірусних препаратів

Спосіб визначення чутливості цитомегаловірусу до противірусних препаратів, який включає взяття у пацієнта з вени крові, виділення сироватки або мононуклеарів та проведення полімеразної ланцюгової реакції з праймерами, які дозволяють ампліфікувати область гена, де локалізовані відомі мутації 460-607, що визначають резистентність цитомегаловірусу до противірусних препаратів, який відрізняється тим, що полімеразну ланцюгову реакцію проводять у присутності пептидних гомологів ДНК з послідовністю GTTCTCCAACGCGCG. Винахід відноситься до медицини і може бути використаний для визначення резистентності цитомегаловірусів до дії противірусних препаратів. Цитомегаловірус (ЦМВ), носійство якого досягає поширення у 60-80% дорослих імунокомпетентних людей, стає причиною небезпечної для життя інфекції в осіб з порушеною імунною системою: хворих на СПІД, реципієнтів трансплантатів кісткового мозку, нирок, серця, печінки та інших органів. Тривале лікування противірусними препаратами ганцикловіром, фоскарнетом чи цидофовіром приводить до появи резистентних ізолятів вірусу. Визначення резистентності ЦМВ до противірусних препаратів необхідне для підвищення ефективності лікування шляхом заміни препарату, до якого розвинулась резистентність, на інший, до якого резистентності немає. Відомо процес діагностики резистентності ЦМВ шляхом культурального дослідження, заснованого на тесті зменшення числа бляшок. Для проведення дослідження до культури фібробластів крайньої плоті людини, що ростуть у виді моношару в 24-лунковому планшеті, додають суспензію, що містить 50-100 бляшкоутворюючих одиниць ЦМВ, та інкубують протягом 1 години. Потім рідину заміщають середовищем, що містить агарозу і противірусний препарат у відповідних розведеннях: ганцикловір (1, 5, 10, 20, 50мкМ) або фоскарнет (62,5, 125, 250, 500, 1000мкМ). Гель обмежує поширення вірусних часток, таким чином, що ними можуть бути уражені тільки клітини, що оточують первинно інфіковані. Клітини культивують 7-10 днів, фіксують метанолом і забарвлюють по Романовському-Гімзе. Підраховують число бляшок (одна бляшка - скупчення загиблих клітин, інфікованих вірусною часткою) і обчислюють 50% інгібуючу дозу (ID50) для противірусного препарату - концентрацію препарату, що приводить до 50% зменшення числа бляшок. Ізоляти вірусу, що мають ID50≥400мкМ для фоскарнета та ID50≥6мкМ для ганцикловіра вважаються резистентними до цих препаратів [1]. Недоліком відомого способу є відсутність стандартизації клітин та умов їх культивування і тривалий час від початку дослідження до отримання результатів. Відомо процес діагностики резистентності ЦМВ до противірусних препаратів шляхом додавання до культури фібробластів легень людини, (19) UA (11) 75254 (13) C2 (21) 20040705446 (22) 07.07.2004 (24) 15.03.2006 (46) 15.03.2006, Бюл. № 3, 2006 р. (72) Чумак Анатолій Андрійович, Абраменко Ірина Вікторівна, Бойченко Павло Констянтинович (73) Науковий центр радіаційної медицини АМН України (56) EP A1 1046400 20.10.2000 A.M. Fillet et all. Natural polymorphism of cytomegalovirus DNA polymerase lies in two nonconserved regions located between domains delta-C and II and between domains III and I. JP F1 11322746 21.11.1999 WO A1 9727480 31.07.1997 3 75254 4 що ростуть у 96-лунковім планшеті, 8 послідовних (GTTCTCCAACGCGCG), що комплементарна посрозведень вірусвмісного середовища і противіруслідовності, специфічній для ганцикловір-чутливого них препаратів в розведеннях: ганцикловір (0,25, ізоляту. Ці спеціально сконструйовані проби, що 1, 4, 16, 32мкМ) або фоскарнет (50, 100, 200, 400, мають комплементарність до області передбачу800мкМ). Після 7-денної інкубації імуноферментваної мутації, але не можуть виступати праймераним методом визначається вміст у лунках антигеми, пригнічують ампліфікацію даної області в тому ну р65 вірусного походження. Ізоляти з випадку, якщо вона не містить нуклеотидів, які ID50≥600мкМ для фоскарнета і ID50≥32мкМ для зазнали мутації. ганцикловіра вважаються резистентними до преПроцес відрізняється від аналога тим, що мопаратів. Ізоляти з ID50≥300 але < 600мкМ для фосдифіковано процес проведення ПЛР, завдяки чому карнета і ID50≥20 але