Спосіб отримання комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну

Спосіб отримання комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну, що включає стабілізацію суцільної крові, відмивання еритроцитів з наступним Винахід стосується галузі біологи, медицини і ветеринарії і може бути використаний в бютехнологм добування біологічно-активних речовин ВІДОМІ способи отримання [Морозов В Г, Хавинсон ВХ Выделение, очистка и идентификация иммуномодулирующего полипептида содержащегося в тимусе телят человека // Биохимия - 1981 Т 46 -Вып 9 -С 1652 - 1659 , Морозов В Г , Хавинсон В X Влияние экстракта из эпифиза на течение экспериментальных опухолей и лейкозов //Эксперим хирургия-1973- №1 -С 1 9 - 2 2 , Оппель В В Нейтральная фракция низкомолекулярных пепсин-пептидов конского гемоглобина //Биохимия -1961 -Т 26-Вып 3 - С 462 - 466] Найбільш близьким до заявляемого є спосіб отримання нейтральної фракції низькомолекулярних пепсин-пептид їв кінського гемоглобіну, що включає розчинення гемоглобіну у воді та змішування з соляною кислотою до отримання 120мл 0,1 н розчину НСІ, який містить 1,42% гемоглобіну, переварювання 23 години при 38,7°С пепсином під шаром толуолу Розщеплення пепсином закінчували зануренням колби на 5 хвилин у киплячу водяну баню Із гідролізату, після охолодження, осаджували білок, який не переварився, і високомолекулярні пептиди шляхом додавання при вструшуванні рівного об'єму 20%-ноі оцтової кислоти Після відстоювання упродовж 2,5 годин рідину фільтрували через беззольний фільтр З фільтрату, який містив нижчі пептиди, оцтову кислоту, видаляли повторним вструшуванням з ефіром, а залишки ефіру-нагріванням на киплячій руйнуванням мембран, денатурацію білка, перетравлення його пепсином, преципітацію великих білків трихлороцтовою кислотою, фільтрування та діаліз суміші, обробку и ацетоном, концентрування та люфілізацію, який відрізняється тим, що додатково використовують галогенвмісну органічну кислоту, осадження білків та дегідратацію ацетоном з додаванням в екстракт двовалентних катіонів цинку та магнію, послідовну очистку на аніоніті та катюніті водяній бані Об'єм рідини доводили водою до 240 мл Визначення азоту (за зміненим методом Конвея) показало, що 52% білка перетворилося у фракцію низькомолекулярних пептидів [В В Оппель Нейтральная фракция низкомолекулярных пепсин-пептидов конского гемоглобина //Биохимия -т 26-вып 3,М ,1961 -С 462 - 466] Однак, відомий спосіб не забезпечує достатнього ступеню видалення баластних речовин, а одержаний комплекс пептидних фрагментів гемоглобіну має недостатньо високий вміст білка, який переходить в низькомолекулярну фракцію, що не дає змогу дослідити біологічну активність низькомолекулярних пепсин-пептидів гемоглобіну В основу винаходу покладено завдання створити спосіб отримання комплексу пептидних фрагментів гемоглобіну, шляхом удосконалення відомого способу, досягти одержання комплексу пептидних фрагментів з низьким вмістом баластних речовин та високим вмістом білка, здатного переходити в низькомолекулярну фракцію та за рахунок цього забезпечити можливість дослідження біологічної активності низькомолекулярних пепсин-пептидів гемоглобіну Поставлену задачу вирішують створенням способу отримання пептидного комплексу гемоглобіну, що включає стабілізацію суцільної крові цитратом натрію, відмивання еритроцитів з наступним руйнуванням мембран, денатурацію білка, перетравлення його пепсином, преципітацію великих білків трихлороцтовою кислотою, фільтрування та діаліз суміші, обробку и ацетоном, концент ю 00 (О 00 48685 рування та люфілізацію, який згідно винаходу відрізняється тим, що додатково для осадження білка та преципітації отриманих комплексів використовують галогенвмісну органічну кислоту, ацетон та додавання в екстракт двовалентних катіонів цинку та магнію, з наступною послідовною очисткою на аніоніті та катюніті Запропонований нами спосіб дає можливість отримати природні пептидні комплекси з високим вмістом низькомолекулярних фракцій білка, що досягається шляхом використання галогенвмісної органічної кислоти, яка має здатність неповоротно денатурувати баластні пептидні речовини Крім того, додавання в екстракт двовалентних катіонів цинку та магнію приводить до утворення координаційних зв'язків метал-білок, що забезпечує особливий стан таких комплексів в розчині і покращує їх здатність преципітуватися Спосіб достатньо простий, не потребує великих фінансів та часу Спосіб здійснювали наступним чином Суцільну кров стабілізували 3,8% цитратом натрію в співвідношенні 1 9 Плазму вилучали центрифугуванням на протязі 20 хвилин при 3000об/хв Еритроцити трикратно відмивали фізіологічним розчином та гемолізували 0,1 н HCL Денатурацію білка проводили 1 годину при 60°С У вилучений гемолізат додавали пепсин враховуючи, що співвідношення його із субстратом повинно становити 2,5%, рН 2,5 Постійно змішуючи гемолізат з пепсином шкубували 4 год , при 37°С, потім преципітували великі білки 30% трихлороцтовою кислотою в кінцевій концентрації 5% Після виділення дисперсного осадку та фільтрування реакційної суміші її діалізували проти дистильованої води до рН 6,0, та концентрували розчином желатину (5 год ,37°С) Вилучену суміш обробляли ацетоном у співвідношенні 1 10 (з 0,1% розчинами хлоридів цинку та магнію) і витримували 18 год при +4°С Осад збирали та відмивали ефіром для видалення залишків трихлороцтової кислоти Преципітат висушували при 60°С Ідентифікація речовини Вивчення фізико-хімічних властивостей речовини показало наявність позитивної біуретової реакції, що свідчить про й пептидну природу в отриманому екстракті Загальний білок (біуретова реакція) складав 13г/л Визначення білка реактивом Неслера 10г/л Це також підтверджується характерним спектром поглинання Оптичну густину водного розчину комплексу в УФ-області вимірювали на спектрофотометрі "СФ-46" (ЛОМО, Росія) В кюветі з товщиною пропускного шару 10мм при довжині хвиль від 190 до ЗООнм Максимум спектру поглинання в УФ-області відмічався при довжині хвиль 200 220нм Оптична густина D2K0 Відношення =0,081-0,9 D2i4 (Государственная Фармакопея XI,выпуск 1,С 34) Молекулярну масу пептидів, що входять до складу комплексу аналізували методом колончатої гель-фільтрацм на акрилексі П-10 (Угорщина), (вища границя молекулярної маси молекул які фільтруються 10KD) При гель-хроматографм проведеній на рідинному хроматографі за загальновідомою методикою, пептиди розділяються на чотири основні фракції Нами, методом іонної хроматографії було досліджено хроматографічний спектр природного пептидного комплексу вилученого з гемоглобіну При дослідженні користувалися колонкою G-15, в якості юнообмінника використовували слабкий аніоніт DEAE - СгН/МН^НбЬ 3 подальшим переведенням у ОН форму Для елюції застосовували фосфатний буфер NaH2PO4 2H2O з рН = 7,5, концентрація NaCI становила від 0,01 до 0,1 М Швидкість потоку складала 1мл за хвилину Фракції збирали за допомогою колектора фракцій YARGO Аналіз іонообмінної хроматографії встановив , що пептидний комплекс гемоглобіну розділявся на п'ять основних фракцій Хроматографічний спектр підтверджується графіком По осі абсцис - час утримання, по осі ординат - оптична густина Таким чином, препарат являв собою комплекс водорозчинних поліпептидів з молекулярною масою 4 - ЮкДа, з максимумом спектра поглинання в УФ області (200 - 210нм), який має характерну хроматографічну криву з 6 основними фракціями, з часом утримання 3, 12, 18, 27, 35, 39 хвилин Отриманий природний пептидний комплекс має високий вміст низькомолекулярних очищених фракцій білка, що в подальшому надасть змогу дослідити біологічну активність низькомолекулярних пепсин-пептидів гемоглобіну 48685 к У 79 to У "Л •р М аз ш fC fry U К • а Ж m ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 ал hШ