Спосіб визначення глікірованого гемоглобіну

Спосіб визначення глікірованого гемоглобіну, який включає проведення гідролізу глікірованого гемоглобіну, забарвлення з тіобарбітуровою кислотою, вимір загального гемоглобіну з подальшим розрахунком, який відрізняється тим, що перед забарвленням попередньо проводять ізоелектричне фокусування в борат-поліольній системі проби гемолізату капілярної крові в мікротрубках в градієнті рН 6,9-7,3. (19) (21) 99031265 (22) 09.03.1999 (24) 15.02.2001 (33) UA (46) 15.02.2001, Бюл. № 1, 2001 р. (72) Корольов Віталій Олександрович, Петров Олександр Васильович (73) Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського 33540 оскільки при підібраному градієнті відбувається ізоелектрофокусування глікірованого гемоглобіну, а решта основних білків крові, які утворюють додатковий фон, при дії кислотою, ізоточка яких інша, йде в розчин, і таким чином з'являється можливість визначення справжнього глікірованого гемоглобіну, тобто, поліпшує критерії аналітичної надійності способу. Запропонованим способом обстежено 17 здорових і 66 хворих на цукровий діабет. При цьому рівень глікірованого гемоглобіну достовірно змінювався у хворих на цукровий діабет порівняно із здоровими (у здорових 5-5,5%, у хворих на цукровий діабет - 8,5-12,0 %), а також добре корелював з показниками вуглеводного обміну (глікіємією, глюкозурією). Спосіб здійснюється таким чином. Спочатку готують розчини. Для цього створюють вихідний трис-боратний буфер - 0,01 М борна кислота і трис (140 мг) в 1000 мл води, рН 7,8-8,0. Потім готують три розчини: розчин № 1 - 4 мг рибофлавіну і 0,04 мл темеду, додають до 100 мл вихідного буферу; розчин № 2 - 0,24 мл темеду і 24 мл розчину № 1 додають до 600 мл вихідного буферу, вимірюють рН; розчин № 3 - 45 мл розчину № 2 додають до 55 мл гліцерину, ретельно перемішують, вимірюють рН. Значення рН розчинів № 2 і № 3 є кінцевими точками графіку, за яким визначають значення рН двох градієнтних розчинів для ізоелектричного фокусування, що відповідає ізоточці глікірованого гемоглобіну рН 6,5-7,3. Ці два градієнтних розчини готують шляхом титрування розчину №3 в розчин № 2 відповідно в двох посудинах (по 50-100 мл). У градієнтні розчини додають акриламід і метиленбісакріламід, відповідно 68 і 2,03 мг на 1 мл розчину. Для проведення ізоелектричного фокусування беруть капіляри 60 х 1 мм і заповнюють їх зверху вниз по черзі трисборатним буфером, градієнтним розчином з більш лужним рН, градієнтним розчином з більш кислим рН. Здійснюють фотополімеризацію до утворення гелів. Потім капіляри з полакриламідним гелем вставляють в апарат ПЕФ-1 з резиновими пробками, з раніше пробитими голкою отворами. Перед дослідженням у пацієнта беруть 0,1 мл оксалату натрію і перемішують вміст. В іншу пробірку, яка містить 16 мл 0,9% хлориду натрію, вносять 0,02 мл нерозведеної капілярної крові і визначають вміст загального гемоглобіну (будь-яким методом). Для гемолізу еритроцитів в оксалатну кров додають 1 краплю ефіру, струшують і залишають на 10 хвилин. У капіляри з гелем і вихідним буфером підшаровують за допомогою мікрошприця 10 мкл гемолізату. Апарат ПЕФ-1 заповнюють вихідним трис-боратним буфером і проводять ізоелектричне фокусування протягом 14-18 годин при напрузі не менш як 20 в/см і температурі 4°С. Після проведення ізоелектрофокусування кожний капіляр виймають із апарату і розтирають у ступці з 0,9 мл дистильованої води до одержання гомогенної маси, яку переносять в хімічну пробірку (для кожного розтертого капіляра окрема пробірка). До цієї гомогенної маси додають 0,5 мл 0,2 н трихлороцетної кислоти, закривають пробірку резиновою пробкою із вставленими в неї ін’єкційними голками і ставлять в киплячу водяну баню. Через 10 хвилин голки виймають із пробок і вміст пробірок кип'ятять ще 50 хвилин. Потім охолоджують пробірки в крижаній воді, далі вносять 0,5 мл 40% трихлороцетової кислоти, струшують і центрифугують при 3000 об/хв протягом 15 хвилин. В суху пробірку відбирають 0,5 мл надосадочної рідини, додають 0,5 мл концентрованої соляної кислоти і 0,05 мл 0,02 м тіобарбітурової кислоти, перемішують, накривають пробірку скляною пробкою "слізкою" і ставлять на 16 хвилин в киплячу водяну баню. Після цього вимірюють оптичну щільність проби на спектрофотометрі при довжині хвилі 432,5 нм в кювету з довжиною оптичного шляху 10 нм. Для виключення впливу поліакриламідного гелю, який присутній у пробі, визначають екстинкцію фону. Для цього капіляр з гелем оброблюють так, як і експериментальну пробу, виключаючи стадію нагрівання в киплячій водяній бані протягом 1 години. Екстинкція фону, як показує практика, величина стабільна, ось чому достатньо одного визначення для серії досліджень. Експериментальну пробу і пробу на фон вимірюють на спектрофотометрі проти контролю на реактиви. Концентрацію глікірованого гемоглобіну визначають за калібровочним графіком, який побудований за стандартними розчинами фруктози: глікірований гемоглобін = С фр 2 ´ С НВ ´ 100% де Сфр - концентрація фруктози в пробі (в мол/л), яка визначена за калібровочним графіком; Снв концентрація сумарного гемоглобіну в пробі (в моль/л); 2 - коефіцієнт, який враховує, що 1 молекула глікірованого гемоглобіну зв'язана с 2 молекулами фруктози. Позитивний ефект. Спосіб дозволяє поліпшити критерії аналітичної надійності, що підвищує точність визначення глікірованого гемоглобіну. При цьому представляється можливим використання капілярної крові, що знижує травматичність обстежених хворих. Також відсутня необхідність виміру оптичної щільності фону кожної проби, оскільки підібрані градієнти, в яких відбувається ізоелектрофокусування глікірованого гемоглобіну, а решта основних білків крові, ізоточка яких інша, ідуть в розчин, що значно спрощує спосіб. Таким чином, запропонований спосіб визначення глікірованого гемоглобіну, який включає в себе високу відтворність і доступність у відношенні реактивів і приборів, може бути використаний в клініко-біохімічних лабораторіях. 2 33540 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3