Спосіб скринінгу фізіологічно активних сполук на гербіцидну активність

Спосіб скринінгу фізіологічно аісгивних сполук на гербіцидну активність, який відрізняється тим, Винахід відноситься до області біологи та органічної хімії, а саме до нового методу скринінгу нових фізіологічно активних сполук на гербіцидну активність (І) Метод має високу чутливість, швидкий у виконанні, не потребує коштовних реактивів і може бути застосований як при розробці нових гербіцидів, так і у практиці сільського господарства Відомо використання лабораторних, вегетаційних та польових ДОСЛІДІВ ДЛЯ скринінгу нових сполук на гербіцидну активність [1, 2] Ці методи використовують нативні рослини для реєстрації активності сполук на гербіцидну активність Також відомо використання методу детектування активності ферменту ацетолактатсинтази (АЛС) (Е С 4 1 318) для ідентифікації СТІЙКОСТІ рослин до дії інгібіторів АЛС [6] Найбільш близьким до запропонованого методу є метод вегетаційних ДОСЛІДІВ для скринінга гербіцидів, який прийнятий нами в якості прототипа (II) [1, 2] Загальними ознаками запропонованого методу (І) і прототипа (II) є те, що вони використовуються для детектування гербіцидної активності ВІДМІННІ ознаки Запропонований метод (І) - використовується для детектування гербіцидної активності і на відміну від базового методу (II) відрізняється швидкістю отримання результатів, простотою у виконанні, не потребує коштовних реактивів, обладнання та великої інфраструктури для виконання (обладнані вегетаційні будинки чи що включає спектрофотометричне детектування накопичення ацетолактату по ацетошу, зміни вмісту котрого є показником активності ферменту ацетолактатсинтази, причому максимальний рівень накопичення ацетошу досягається шляхом інгібування ферменту редуктоізомерази пдроксикетокислот, а як інгібітори редуктоізомерази пдроксикетокислот використовуються ПОХІДНІ карбонових кислот ділянки польових ДОСЛІДІВ з великими площами для ДОСЛІДІВ) В основу винаходу поставлено задачу створення нового методу скринінгу фізіологічно активних сполук на гербіцидну активність, який би був більш швидким у виконанні, більш специфічним та більш дешевим Задача винаходу досягається розробкою нового методу скринінгу фізіологічно активних сполук на гербіцидну активність, який заснований на спектрофотометричному детектуванні активності ферменту ацетолактатсинтази чутливих до дії токсикантів видів рослин Винахід ілюструється наступним прикладом Приклад Рослини сої Нива вирощували в вегетаційних умовах в посудинах МІСТКІСТЮ 0,5КГ на суміші луго во-черноземного грунту та піску у співвідношенні 1 1 Вміст гумусу в суміші 1,5% [4], рН (КСІ) 6,0 [4] Денна температура повітря становила 20 - 22°С, нічна - 18 - 20°С Вологість ґрунтової суміші підтримували на рівні 60% повної вологоємності В дослідах використовували 75%-ний хлорсульфурон (глін) (І\І-[(4-метил-6-метокси-1,3,5триазиніл-2)-амшокарбоніл]-2-хлорбензолсульфонамід) фірми DuPont, США, і 1,1циклопропандикарбонову кислоту фірми Oldnch, США Висічки листя сої шкубували на протязі 15год при 20°С в розчині 1,1-циклопропандикарбоновоі кислоти при рН 7,0, потім додавали інгібітор АЛС і 00 о> 00 о ю 50898 витримували додатково на протязі Згод Активність АЛС визначали по накопиченню ацетолактату, який детектували спектрофотометрично після кислотного декарбоксилювання до ацетошу [6] Статистичні розрахунки проводили за Доспєховим [3] АЛС каталізує реакцію синтезу ацетолактату з двох молекул пірувату (біосинтез валіну і лейцину) чи пірувату і а-кетобутирату (біосинтез ізолейцину) Наступним, за АЛС, в ланцюгу синтезу амінокислот є редуктоізомераза пдроксикетокислот (РІГКК) (EC 1 1 1 86) РІГКК каталізує утворення а,р-дипдроксмзовалерату (біосинтез валіну і лейцину) чи а,р-дипдрокси-р-метилвалерату (біосинтез ізолейцину) Відомими інгібіторами ферменту є Ное-704 (2-диметилфосфшоіл-2-пдроксиоцтова кислота), 1,1-циклопропандикарбонова кислота, Nізопропілоксалілпдроксамат [5] Використання інгібіторів РІГКК запобігає утворенню ізовалерату з ацетолактату і накопиченню останнього в чутливих рослинах Завдяки відкриттю селективних інгібіторів РІГКК був сформульований новий ПІДХІД ДО детектування стійких до дії гербіцидів видів бур'янів [6], який заснований на утворенні високої концентрації ацетолактату з наступним визначенням чутливості рослини до інгібітору АЛС по величині зниження рівня ацетолактату Зниження вмісту ацетолактату в клітинах рослин під дією інгібіторів АЛС в присутності інгібітору РІГКК дозволяє однозначно зв'язати зниження АЛС активності з дією фізіологічне активної сполуки При відсутності варіанту з дією шпбітора РІГКК зниження вмісту ацетолактату не обов'язково пов'язано з дією гербіцидів Нами при вивченні дії 1,1циклопропандикарбонової кислоти показано (таблиця 1), що у листях сої максимум накопичення ацетолактату відмічається при внесенні шпбітора в концентрації 0,1 - 1,0мМ Вміст ацетолактату визначали спектрофотометричне після його декарбоксилювання до ацетошу [6] Внесення хлорсульфурону на фоні 1,1-циклопропандикарбоновоі кислоти призводить до зниження вмісту ацетолактату Враховуючи, що реалізація фітотоксичності сульфонілсечовин та інших інгібіторів АЛС проявляється досить повільно, від 1 тижня і довше, даний метод може бути використаний для експресвизначення присутності інгібіторів АЛС в об'єктах навколишнього середовища Метод також може бути використаний для скринінгу нових фізіологічно активних сполук на гербіцидну активність Перевагами методу є швидкість і простота виконання, а також низька вартість реактивів Таким чином, застосування 1,1циклопропандикарбонової кислоти в концентрації ЮОмкМ призводить до накопичення ацетолактату у висічках листя сої Зміни вмісту ацетолактату під дією інгібіторів АЛС і РІГКК є основою для швидкого (табл 2) визначення вмісту хлорсульфурону та інших фізіологічно активних сполук - гербіцидів, що інгібують АЛС Таблиця 1 Вплив 1,1-циклопропандикарбоновоі кислоти і хлорсульфурону на накопичення ацетошу у висічках листя сої Варіанти досліду 1,1-циклопропандикарбонова Гербіцид, мкМ кислота, мкМ 1 10 100 1000 100 Хлорсульфурон, 1 100 Хлорсульфурон, 10 Хлорсульфурон, 1 Хлорсульфурон, 10 НІР 0,95 Вміст ацетошу мкг г 1 год 1 0,2 3,3 3,9 4,1 0,2 0 0 0 0,4 Таблиця 2 Співставлення запропонованого методу визначення гербіцидної дії нових і відомих фізіологічно активних сполук шляхом детектування активності ацетолактатсинтази (АЛС) і методу визначення гербіцидної дм в вегетаційних умовах (прототип) Варіанти досліду Тривалість дослідження гербіцидної активності Прототип - вегетаційний дослід 2 - 4 тижні Запропонований метод - детектування АЛС-активності 1 доба Література 1 Методические рекомендации по испытанию препаратов на гербицидную активность / Черкассы Отделение НИИТЭХИМа, 1984 -27с 2 Лой Н П , Кукаленко С С О системе скрининга гербицидов -М НИИТЭХИМ, 1983 -20с 3 Доспехов Б А Методика полевого опыта - М Агропромиздат, 1985 -351с 4 Радов А С , Пустовой И В , Корольков А В Практикум по агрохимии - М Агропромиздат, 1985 -312с 5 50898 6 5 Abell L M Biochemical approaches to herbicide 7 The Pesticide Manual / Ed CTomhn - United discovery advances in enzyme target identification Kingdom BCPC Publications, 1994 -1350p and inhibitor design//Weed Sci -1996 -44 - P 734 8 Stidham MA Herbicides that inhibit -742 acetohydroxyacid synthase//Weed Sci -1990 -39 6 Gerwick В С , Mireles L С , Eilers RJ Rapid diagnosis of ALS/AHAS-resistant weeds // Weed Technology -1993 -7 -P 519-524 - P 428 - 434 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71