Імуносенсорна тест-система на основі поверхневого плазмонного резонансу для виявлення антитіл проти вірусу епштейна-барр

Імуносенсорна тест-система на основі поверхневого плазмонного резонансу для виявлення антитіл проти вірусу Епштейна-Барр, яка характеризується тим, що містить кварцовий біочип з золотим напиленням, на якому іммобілізований вірус Епштейна-Барр як антиген. (19) (21) u200905251 (22) 26.05.2009 (24) 12.07.2010 (46) 12.07.2010, Бюл.№ 13, 2010 р. (72) НЕСТЕРОВА НАДІЯ ВІТАЛІЇВНА, ЗАГОРОДНЯ СВІТЛАНА ДМИТРІВНА, БАРАНОВА ГАЛИНА ВАСИЛІВНА, ГОЛОВАНЬ АННА ВОЛОДИМИРІВНА, УШЕНІН ЮРІЙ ВАЛЕНТИНОВИЧ, ХРИСТОСЕНКО РОМАН ВАСИЛЬОВИЧ (73) ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ 3 Приклад 1. Чипи з напиленим золотом промивали дистильованою водою та очищали сумішшю, яка містила дистильовану воду, 35%-й перекис водню та 37%-у сірчану кислоту у співвідношенні 5:1:1. Далі чипи тричі промивали дистильованою водою. Для покращання іммобілізації антигену всю поверхню чипа покривали розчином (2мг/мл) Dextran 17 000 (Sigma)-0,05% цитратний буфер, рН 5,0-5,2, і витримували протягом 5год. при кімнатній температурі (20-25°С). Промивали скельця трьома змінами цитратного буферу і покривали всю поверхню золота розчином антигену (білки вірусу Епштейна-Барр) в цитратному буфері. Витримували при 4-8°С протягом 18-24год. Тричі промивали цитратним буфером і блокували вільні місця на біочипах 1% БСА в цитратному буфері протягом 1год. при кімнатній температурі. Біочипи тричі промивали цитратним буфером і ретельно висушували на повітрі. Готові біочипи зберігали при 4-8°С у малих стерильних ємкостях, які заклеювали клейкою плівкою з метою запобігання дії повітря. Використання способу пояснює приклад 2. Приклад 2. Для визначення антитіл проти ВЕБ використовували біочипи отримані способом, що заявляється, з іммобілізованими білками ВЕБ на поверхні та двоканальний "Плазмон 6"-біосенсор. Канал 1 використовували в якості контрольного. Через канал 2 - дослідний, щоб уникнути неспецифічного зв'язування ВЕБ-антитіл, спочатку пропускали негативну сироватку людини. Відмивали матеріал, що не зв'язався, і пропускали сироватку крові хворого на ВЕБ-інфекцію. Облік результатів взаємодії антиген-антитіло здійснювали шляхом кількісного визначення кута відхилення у кутових секундах (к.с.) впродовж часу і аналізували дані за допомогою комп'ютерної програми Origin 6.0 (Фіг.). При розробці імуносенсорної тест-системи вираховували граничне значення (ГЗ), сумуючи середнє значення показника кута відхилення негативних сироваток (аналізували 25 сироваток) та трьох середніх відхилень. При проведенні аналізу значення сироватки вважається позитивним, якщо її показник кута відхилення перевищує ГЗ на 10%. У разі, якщо значення показника кута відхилення нижче ГЗ на 10%, сироватка є негативною. Отримані дані в імуносенсорній тест-системі порівнювали з даними цих сироваток в імуноферментному аналізі. Для сконструйованої тест-системи визначали чутливість та специфічність. Чутливість є відношення кількості сироваток, які мали позитивні результати в аналізі, до їх суми з кількістю хибно 51125 4 негативних результатів, що виражено у відсотках. Чутливість імуносенсорної тест-системи становила 98%. Специфічність тест-системи є відношення кількості сироваток, які показали негативний результат в аналізі, до їх суми з кількістю хибно позитивних результатів, що виражено у відсотках. Специфічність сконструйованої імуносенсорної тест-системи становила 100%. Усі сироватки тестували у трьох повторах. Аналіз отриманих даних свідчить про досить високу відтворюваність результатів (95%). Аналізуючи одержані результати по розробці імуносенсорної тест-системи для виявлення антитіл проти ВЕБ в сироватках крові хворих можна зробити висновок про можливість застосування методу ППР поряд з імунохімічним методом, в тому числі і ІФА. В той же час метод ППР має ряд переваг: він одноступінчатий, не потребує мічених макромолекул, дозволяє стежити та отримувати інформацію в ході проведення аналізу. Він може бути достатньо перспективним для використання в лабораторній діагностиці вірусних інфекцій. Перевагою застосування методу ППР в діагностиці інфекційних захворювань є експресне отримання інформації в реальному часі стосовно етіологічного збудника захворювання, відсутність використання мічених реагентів та автоматизоване проведення аналізу. На Фіг. зображена крива аналізу сироватки крові хворого при використанні двоканального пристрою "Плазмон 6": по осі ординат - кут відхилення (к.с.) по осі абсцис - час проведення експерименту (сек.). Джерела інформації: 1. П.М. Болтовець, Н.В. Нестерова. Застосування методу поверхневого плазмонного резонансу у вірусологічних дослідженнях // Мікробіол. журн.- 2006 .- 68, N3. - С.86-98. 2. J.L.Kutok and F.Fang. Spectrum of EpsteinBarr virus-associated diseases // Annu. Rev. Mech. Dis. - 2006. - 4, N1. - P.375-404. 3. Anne K. Junker. Epstein-Barr Virus // Pediatrics in Review. - 2005. - 26, N3. - P.79-84. 4. Matthew P. Thompson and Razelle Kurzrock. Epstein-Barr Virus and cancer//Clinical Cancer Research.-2004. - 10, N3. - P.803-813. 5. Murray P.G., Young L.S., The Role of the Epstein-Barr Virus in Human disease // Ftront. Biosci. - 2002. - 2, N3. - P.519-540. 6. Homola J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors//Anal. Bioanal. Chem. - 2003. - 377. - P.528-539. 5 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 51125 6 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601