Спосіб корекції стану острівців лангерганса при алоксановому діабеті

Спосіб корекції стану острівців Лангерганса при алоксановому діабеті засобом із антиоксидан 3 51646 інститут медичної реабілітації та курортології. №20040503505; заявл. 11.05.2004; опубл. 17.01.2005.- Бюл. "Промислова власність" №1.). Недоліком аналогу є те, що не досліджувалися і, тому не враховувалися, гістологічні зміни острівців Лангерганса при інтоксикації алоксаном моногідратом, тобто не застосовувався найбільш інформативний метод оцінки стану інсулінпродукуючого апарату підшлункової залози - гістологічне дослідження. Прототипом корисної моделі є спосіб корекції порушень морфометричного стану острівців Лангерганса підшлункової залози, викликаних стрептозотоцином за допомогою засобу, який стимулює регенеративні процеси в інсулінпродукуючому апараті підшлункової залози (Пат. 38418 Україна, МПК А 61 К 31/165 Засіб для стимуляції регенеративних процесів в інсулінпродукуючому апараті / Полторак В. В., Горбенко Н. І., Гладкіх О. І., Іванова О.В.; заявник та власник патенту Український науково-дослідний інститут фармакотерапії ендокринних захворювань. №2000063870; заявл. 30.06.2000; опубл. 15.05.2001.- Бюл. "Промислова власність" №4). В основу способу-прототипу покладено визначення рівня глюкози сироватки, порушення толерантності до глюкози у крові щурів, визначення вмісту в печінці щурів малонового диальдегіду та морфометричний аналіз змін в панкреатичних острівцях за умов стрептозотоцинового діабету. Недоліком прототипу є те, що не вивчено процес впливу алоксану моногідрату і досліджуваного засобу для стимуляції регенеративних процесів в інсулінпродукуючому апараті підшлункової залози на питому вагу острівців Лангерганса, середню кількість клітин на зрізі одного острівця Лангерганса, відсоток бета-клітин серед клітин острівців Лангерганса, відсоток клітин з проявами некрозу. Для з'ясування причин підвищення рівня базальної глікемії насправді найбільш принципово вияснити співвідношення між процесами утворення та загибелі бета-клітин острівців Лангерганса. В прототипі досліджували лише відсоток різномірності острівців, відсоток малих бета-клітин 4 в 1 острівці, число острівців, площину острівця. Недоліком вищезгаданого методу також є те, що спосіб-прототип для інших видів експериментального діабету, окрім стрептозотоцинового, не апробований, тому може бути для них неадекватним. Нами пропонується спосіб, який усуває вказані недоліки, тобто дозволяє провести гістологічний аналіз тканини підшлункової залози щурів і визначити питому вагу острівців Лангерганса, середню кількість клітин на зрізі одного острівця Лангерганса, відсоток бета-клітин серед клітин острівців Лангерганса, відсоток клітин з проявами некрозу а, отже, і судити про ступінь порушення вуглеводного обміну при алоксановому діабеті та введенні засобу з антиоксидантною та імуномодулюючою дією. В основу корисної моделі поставлене завдання відновлення морфологічного стану інсулінпродукуючого апарату підшлункової залози внаслідок руйнування бета-клітин острівців Лангерганса шляхом внутрішньоочеревинного введення алоксану моногідрату щурам. Поставлена задача вирішується шляхом використання препарату мелатоніну, який впливає на морфометричні параметри острівців Лангерганса, що оцінювали за допомогою визначення питомої ваги острівців Лангерганса, середньої кількості клітин на зрізі одного острівця Лангерганса, відеотеку бета-клітин серед клітин острівців Лангерганса, відсотку клітин з проявами некрозу (методика фарбування зрізів тканин з використанням паральдегідного фуксину по Гоморі та гематоксилін-еозин). Спільними ознаками прототипу та корисної моделі, що пропонується, є використання засобу з антиоксидантними та імуномодулюючими властивостями при експериментальному пошкодженні острівців Лангерганса. Відмінність корисної моделі та прототипу полягає у визначенні питомої ваги острівців Лангерганса, середньої кількості клітин на зрізі одного острівця Лангерганса, відсотку бета-клітин серед клітин острівців Лангерганса, відсотку клітин з проявами некрозу для визначення морфометричного стану острівців Лангерганса підшлункової залози та його корекції. Таблиця Ознаки Експериментальна модель Об'єкт дослідження Прототип Стрептозотоциновий діабет Кров, печінка, острівці Лангерганса підшлункової залози Препарат Фенсукцинал Що досліджували Морфометричний аналіз змін в острівцях Лангерганса підшлункової залози: % різномірності острівців, % малих бета-клітин в 1 острівці, число острівців, площину острівця, а також стан перекисного окиснення ліпідів у печінці, рівень глюкози в крові. Теоретичною передумовою здійснення корисної моделі є експериментальна інтоксикація алоксану моногідратом, в структурі якого є карбонільні групи і атоми азоту, які забезпечують Спосіб, що заявляється Алоксановий діабет Острівці Лангерганса підшлункової залози Мелатонін Морфологічний стан острівців Лангерганса підшлункової залози: питому вагу острівців Лангерганса, середню кількість клітин на зрізі одного острівця Лангерганса, відсоток бета-клітин серед клітин острівців Лангерганса, відсоток клітин з проявами некрозу. можливість взаємодії з SH-групами бета-клітин і вільне проникнення його по глюкозним каналам, що веде до руйнування інсулінопродукуючого апарату з послідуючим вивченням морфометричного 5 51646 стану острівців Лангерганса підшлункової залози та корекцією мелатоніном, який є гормоном епіфізу, що синтезується з амінокислоти триптофану переважно у темновий період доби та стимулює знешкодження оксиду азоту та припинення автоімунного процесу в бета-клітинах острівців Лангерганса підшлункової залози.Спосіб, що заявляється, здійснюється наступним чином. Алоксановий діабет у щурів викликають шляхом внутрішньо очеревинного введення 5% розчину алоксану моногідрату з розрахунку 17мг на 100г маси тварини. Починаючи з 4-ї доби, на фоні інтоксикації алоксану моногідратом внутрішньоочеревинно вводиться розчин мелатоніну ("Sigma", США) у дозі 10мг/кг маси тварини впродовж 7-ми днів. Тварин забивали шляхом декапітації на 12-ту добу від початку експерименту. Отриманий орган фіксували в 10% нейтральному буферному розчині формаліну. Далі шматочки тканини зневоднювали і заливали в парафін за стандартною методикою. Зрізи тканин товщиною 5±1мкм отримували на санному мікротомі. Гістологічне дослідження підшлункової залози проводили згідно методики фарбування зрізів тканини з використанням паральдегідного фуксину по Гоморі та згідно методики гематоксилін-еозин. Мікрофотографування і морфометричне дослідження проводили на універсальному дослідницькому мікроскопі ЛЮМАМ - Р8 (Росія, ЛОМО). Використання способу пояснюється конкретними прикладами. Приклад використання способу №1. Отримані зрізи тканини підшлункової залози щурів, яких впродовж всього експерименту утримували в умовах природного освітлення (досліди виконані в лютому-березні 2009 року). Для відтворення алоксанового діабету (експериментальна модель патології бета-клітин) вводили алоксану моногідрат внутрішньоочеревинно одноразово у дозі 17мг на 100г маси тварини. Паралельно була відібрана група тварин, які утримувались за таких же умов освітлення, без інтоксикації алоксану моногідратом. На 12-ту добу після останньої затравки проводили евтаназію контрольних та інтоксикованих тварин. В зрізах тканин підшлункової залози, фарбування яких здійснювали за допомогою паральдегідного фуксину по Гоморі, визначали морфометричний стан острівців Лангерганса за питомою вагою острівців Лангерганса, середньою кількістю клітин на зрізі одного острівця Лангерганса, відсотоком бета-клітин серед клітин Комп’ютерна верстка Л. Купенко 6 острівців Лангерганса, відсотком клітин з проявами некрозу. В неінтоксикованій групі тварин питома вага острівців Лангерганса становила 0,948±0,0134%; середня кількість клітин на зрізі одного острівця Лангерганса - 82±1,2; відсоток бета-клітин серед клітин острівців Лангерганса склав 44,0±2,32%; клітин з проявами некрозу не спостерігалося. В той час в діабетній групі питома вага острівців Лангерганса становила 0,084±0,0018%; середня кількість клітин на зрізі одного острівця Лангерганса - 6±0,2; відсоток бета-клітин серед клітин острівців Лангерганса склав 0,2±0,03%; відсоток клітин з проявами некрозу становив 97,0±4,51%. Приклад використання способу №2. Отримані зрізи тканин підшлункової залози від двох груп тварин, яких утримували в умовах освітлення та моделювали діабет за описаною вище методикою, а також від тварин третьої групи, яким на фоні алоксанового діабету вводили препарат мелатоніну. Визначають морфометричний стан острівців Лангерганса за питомою вагою острівців Лангерганса, середньою кількістю клітин на зрізі одного острівця Лангерганса, відсотоком бетаклітин серед клітин острівців Лангерганса, відсотком клітин з проявами некрозу, проводили як описано в прикладі №1. Визначено, що у групі тварин, яким уводили мелатонін на фоні алоксанового діабету підвищилась питома вага острівців Лангерганса - 0,589±0,0214%; та середня кількість клітин на зрізі одного острівця Лангерганса 45±0,9; відсоток бета-клітин серед клітин острівців Лангерганса перевищував показники інтактного контролю - 57,7±2,67%; зменшився, у порівнянні з показниками діабетної групи тварин, відсоток клітин з проявами некрозу - 4,6±1,14%. Це свідчить про відновлення окисно-відновних процесів в мітохондріях та підвищення глюкозостимульованої секреції інсуліну, а також про гіпоглікемічні можливості гормону пінеальної залози - мелатоніну. Також можна рекомендувати застосування даної речовини в комплексній терапії гіперглікемічних станів. Технічний результат: вищеописаний спосіб дозволяє визначити морфометричний стан острівців Лангерганса за питомою вагою острівців Лангерганса, середньою кількістю клітин на зрізі одного острівця Лангерганса, відсотоком бетаклітин серед клітин острівців Лангерганса, відсотком клітин з проявами некрозу на фоні алоксанового діабету та корегувати показники за допомогою препарату мелатоніну. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601