Спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини

Спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини, який включає виділення моноцитів з наступним їх культивуванням у присутності гранулоцит-макрофагального колонієстимулювального фактора для отримання дендритних клітин та стимуляцією їх функціонального дозрівання, який відрізняється тим, що для стимуляції функціонального дозрівання отриманих дендритних клітин використовують пептидоглікан S.aureus. (19) (21) u200913923 (22) 30.12.2009 (24) 10.08.2010 (46) 10.08.2010, Бюл.№ 15, 2010 р. (72) СКІВКА ЛАРИСА МИХАЙЛІВНА, ШВЕЦЬ ЮЛІЯ ВІКТОРІВНА, ХРАНОВСЬКА НАТАЛІЯ МИКОЛАЇВНА, ПОЗУР ВАЛЕНТИНА ВОЛОДИМИРІВНА, ФЕДОРЧУК ОЛЕКСАНДР ГРИГОРОВИЧ, ГРИЦЕНКО ЛЮДМИЛА МИХАЙЛІВНА (73) КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА 3 51890 шляхом додавання до середовища культивування бактеріального ЛПС. Недоліком вказаного способу є висока токсичність ЛПС, котра ускладнює застосування ЛПС для стимуляції дозрівання дендритних клітин in vivo. Ще одним недоліком цього способу є низька стимулювальна здатність ЛПС, наслідком якої є низький рівень дозрівання ДК і знижена їх здатність стимулювати протипухлинну імунну відповідь. В основу корисної моделі поставлена задача створити спосіб стимуляції фукціонального дозрівання дендритних клітин, який забезпечував би максимальну стимуляцію їх антигенпрезентувальної здатності, включав би використання мінімально токсичних реагентів, що давало б змогу безперешкодно застосовувати його для стимуляції функціонального дозрівання ДК як in vitro, так і in vivo і мав би знижену, порівняно з існуючим прототипом вартість. Поставлена задача вирішена тим, що в способі стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, який включає сепарацію моноцитів з периферичної крові хворого, культивування отриманих клітин упродовж 6 діб у присутності ГМ-КСФ та стимуляцію їх функціонального дозрівання, згідно з корисною моделлю, стимуляцію функціонального дозрівання утворених ДК забезпечують шляхом додавання до середовища культивування ПГ S.aureus. Використання бактеріального пептидоглікану забезпечує високий рівень стимуляції антигенпрезентувальної здатності утворених ДК, має значно нижчу токсичність і вартість. Можливість здійснення корисної моделі ілюструється прикладом, який не обмежує обсяг правової охорони. Приклад конкретного використання: У практично здорових донорів стерильно отримували периферичну кров з ліктьової вени в об'ємі 15-20мл і збирали в пробірку з додаванням 25 МО/мл гепарину («Гедеон-Ріхтер», Угорщина). Отриману кров відстоювали упродовж 40хв при t 20-22°C для відділення лейкокомаси з плазмою від еритроцитарної маси. Далі лейкоцити концентрували шляхом центрифугування лейкомаси при 200g упродовж 10 хвилин. Суспензію лейкоцитів сепаративно розділяли на градієнті щільності фікол-верографін ( =1,077г/см3) при 200g упродовж 40 хвилин для отримання фракції мононуклеарних лейкоцитів. Отримані мононуклеарні лейкоцити дворазове відмивали центрифугуванням при 150g упродовж Юхвилин у розчині Рінгера. На наступному етапі проводили сепарацію моноцитів за їх 4 здатністю адгезувати на пластиковій поверхні. Для цього отримані клітини ресуспендували у середовищі культивування (середовище RPMI-1640 («Sigma» з 2мМ L-gly, 100мкг/мл стрептоміцину та 100од/мл пеніциліну) та інкубували в пластикових чашках Петрі (d=90 mm, «Spectar») при 37°С, 5% СO2 упродовж 3 годин. Після інкубації клітини м'яко струшували та видаляли ті, що не прикріпилися, шляхом їх змивання попередньо прогрітим до 37°С середовищем RPMI-1640. Концентрацію клітин, що адгезували, доводили до 0,5х106 /мл аутологічної плазми та 100нг/мл ГМ-КСФ («Leucomax» фірми "Novartis"/'"Schering-Plaugh", Швейцарія) або рекомбінантний ГМ-КСФ людини («Decton Dickinson», США). Такі умови є найбільш оптимальним для генерації ДК. Клітини культивували впродовж 6 діб при 37°С в атмосфері з 5% CO2. Після цього для забезпечення функціонального дозрівання ДК в середовище культивування додавали ЛПС або ПГ в концентраціях 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0мкг/мл і інкубували ще 24 години. На 8 добу культивування аналізували фенотипові властивості клітин, а також їх функціональні властивості в реакції змішаної культури лімфоцитів (ЗКЛ), для чого до ДК додавали алогенні лімфоцити (ЛЦ) в співвідношенні ДК/ЛЦ - 1/10 і інкубували протягом 3 діб. Після цього визначали ДНК статус лімфоцитів, що проліферували, з використанням методу проточної цитофлуориметрії. Для визначення фенотипових властивостей ДК обробляли моноклональними антитілами анти-СD86-FIТС ("Dako", Данія) та анти-HLA-DR-PE ("Сорбент", Росія), фіксували 1% розчином параформальдегіду. Аналізували фенотип ДК з використанням проточного цитофлуориметру FACScan (Becton Dickinson, США) і програми обробки даних CellQuest. Для визначення ДНК статусу лімфоцити після інкубації з ДК інкубували у 1% розчині Triton Х-100 у ЗФР з додаванням РНК-ази (25мкг/мл) і ДНК-тропного барвника пропідій-йодиду (РІ) (5мкг/мл). Далі клітини відмивали і фіксували 1% розчином параформальдегіду. Аналізували проби з використанням проточного цитофлуориметру FACScan (Becton Dickinson, США) і програми обробки даних ModFit. Аналіз фенотипових властивостей отриманих ДК після їх обробки ПГ показав високий рівень експресії костимуляторної молекули ДК - CD86 та важливої для презентації антигенів поверхневої молекули ДК HLA-DR, що свідчить про фенотипову зрілість оброблених клітин. Результати аналізу функціональних властивостей ДК приведені в таблиці. Проліферативний індекс лімфоцитів після реакції в змішаній культурі лімфоцитів (%) Концентрація препарату, мкг/мл 0.1 0.2 0.5 1.0 2.0 5.0 Контроль (ФГА) 48.3 Варіанти досліду ЛПС 39.8 44.4 43.5 39.4 45.4 ПГ 34.1 43.4 41.7 43.9 48.1 5 51890 Однією з ключових властивостей зрілих ДК є здатність активно стимулювати розвиток специфічних до антигену клонів Т-клітин in vivo. Як відомо, після взаємодії зі зрілими ДК Т-клітини активуються, проліферують і далі диференціюють в ефекторні клітини. Здатність стимулювати проліферацію лімфоцитів за допомогою ДК in vitro, як правило, вивчають з використанням реакції змішаної культури лімфоцитів (ЗКЛ). Проліферативна активність лімфоцитів оцінюється після аналізу їх ДНКстатусу за проліферативним індексом. Проліферативним індексом вважають відсоток клітин, які активно діляться і знаходяться в S- та G2-М-фазах клітинного циклу. Як відомо, за умов відсутності активної імунної відповіді Проліферативний індекс лімфоцитів периферичної крові практично здорової людини становить до 10% клітин [3]. При інкубації лімфоцитів з поліклональним активатором лімфоцитів ФГА (позитивний контроль проліферації), Проліферативний індекс становив 48.3%. Проліферативні індекси лімфоцитів після додавання ДК, стимульованих до дозрівання ЛПС і ПГ мають порівняні значення. ДК, стимульовані ПГ у високих концентраціях (1 та 2мкг/мл), чинять навіть більш виразний активаторний вплив на проліферацію Т-лімфоцитів, ніж ДК, стимульовані ЛПС у таких же концентраціях. Спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини, що патентується, забезпечує отримання функціонально зрілих клітин завдяки високій імуномодуляторній активності ПГ, використовуваного в якості стимулятора функціонального дозрівання клітин. Застосування ПГ замість ЛПС або ФНП дозволяє здешевити процедуру, оскільки вартість ПГ на 30% нижча за вартість ЛПС і в 700 разів нижча за вартість ФНП. Пропонований спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини, безпечний Комп’ютерна верстка Л.Купенко 6 для застосування, оскільки використовуваний в ньому ПГ має токсичність, значно нижчу, ніж ЛПС (4293 mg/kg порівняно з 500 ( /kg для ЛПС). Джерела інформації: 1. Chag A.E., Redman B.G., Whitfield J.R. et al. A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer// Clin. Cancer Res. -2002. - Vol.8. - P. 1021-1032. Храновська Н.М., Гріневич Ю.Я. Метод одержання аутологічної протипухлинної вакцини на основі дендритних клітин (методичні рекомендації), К.: Український центр наукової медичної інформації та патентноліцензійної роботи, 2006, с.6-7. М. Й. Лукашина, А. В. Смирнова, В. А. Алиев, И. В. Самойленко, Н. Н Семенов, В. П. Вейко, Й. Н. Михайлова, Ю. А. Барсуков, А. Ю. Барышников Дендритные клетки в терапии колоректального рака // Вестник российского онкологического научного центра имени Н.Н.Блохина РАМН.- 2008.- том. 19, №3: с.35-42 2. Ueda Y, Itoh T, Fuji N, Harada S, Fujiki Н, Shimizu К, Shoizaki AJwamoto A, Shimizu T, Mazda 0, Kimura T, Sonoda Y, Taniwaki М, Yamagishi Н. Succesful inductionof clinically competent dendritic cells from granulocyte colony-stimulating factormobilized monocytes for cancervaccine therapy// Cancer Immunil Immunother.- 2007.- 56 (3):p.381389. Palucka AK, Akagawa E, Ueno H, Fay J, Banchereau J. LPS activated dendritic cell vaccine in combination with immunomodulatory dose of cyclophosphamide in patients with stage IV melanoma: preliminary report from the phase I/lia clinical trial// J ClinOncoL-2008.- 26: abstr 3049. Comparative evaluation of techniquesfor the manufacturing of dendritic cell-based cancer vaccines// Jcell Мої Med.- 2009.- 13(1): p.125-135. 3. Меньшиков В.В. Клиническая лабораторная диагностика // Частные аналитические технологии в клинической лаборатории. М.: ЛабинформРАМЛД, 1999. С. 170-177. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601