Фосфоліпідний масложировий продукт та спосіб нормалізації функціонального стану мононуклеарних клітин крові людини

1. Фосфоліпідний масложировий продукт, який містить рослинну олію та фосфоліпіди, який відрізняється тим, що додатково містить цистеїн та/або ліпоєву кислоту, а також альфа-токоферол, бета-каротин, спирт етиловий та воду у наступному співвідношенні компонентів, мас. %: фосфоліпіди 8,35-20 альфа-токоферол 0,016-1,5 цистеїн та/або ліпоєва кислота 0,017-0,5 бета-каротин 0,015-0,035 спирт етиловий (96º) 15-20 олія рослинна 40-50 вода решта, причому як фосфоліпіди продукт містить фосфоліпіди, які попередньо обробляють у водноспиртовому розчині протягом 15-24 годин, а продукт має консистенцію емульсії. 2. Спосіб нормалізації функціонального стану мононуклеарних клітин крові людини за допомогою масложирового фосфоліпідного продукту, який відрізняє ться тим, що використовують масложировий фосфоліпідний продукт за п. 1. UA (21) a200805919 (22) 26.12.2005 (24) 12.01.2009 (62) a200512538, 26.12.2005 (46) 12.01.2009, Бюл.№ 1, 2009 р. (72) КОРДЮМ ВІТАЛІЙ АРНОЛЬДОВИЧ, U A, ЛИХАЧОВА ЛЮДМИЛА ІВАНІВН А, UA, ЛИСЕНКО СВІТЛАН А ПЕТРІВН А, UA, НОВІКОВА СВІТЛАНА МИКОЛАЇВН А, U A, КАРАБАНЬ ІРИНА МИКОЛАЇВНА, U A (73) КОРДЮМ ВІТАЛІЙ АРНОЛЬДОВИЧ, U A (56) UA C2 74427, 15.12.2005. RU C1 2137387, 20.09.1999. RU C1 2129801, 10.05.1999. RU C1 2199879, 10.03.2003. RU C1 2164755, 10.04.2001. RU C2 2194417, 20.12.2002. RU C2 2194418, 20.12.2002. RU C1 2199876, 10.03.2003. RU C1 2199877, 10.03.2003. RU C1 2199878, 10.03.2003. C2 2 (19) 1 3 85349 4 людини або людини похилого віку. Окрім сказаноФосфоліпіди 8,35-20 го, приготування даного харчового продукту є баАльфа-токоферолу 0,016-1,5 гатоетапним процесом, що потребує великих виЦистеїну та/або ліпоєвої кислоти 0,017-0,5 трат часу, спеціальної апаратури, значних витрат Бета-каротину 0,015-0,035 енергії. Спирту етилового (96°) 15-20 У основу пропонованих винаходів поставлено Олії рослинної 40-50 задачу створення способу визначення функціонаВоди до 100. льного стану організму людини за функціональним а згаданий фосфоліпідний масложировий харстаном мононуклеарних клітин її крові, способу човий продукт призначають у кількості, що відповінормалізації стану клітинних мембран організму дає фізіологічним нормам. людини і такого фосфоліпідного масложирового Поставлена задача вирішується і застосуванхарчового продукту, який би легко засвоювався ням пропонованого фосфоліпідного масложировоослабленим організмом хворої людини або людиго харчового продукту, що містить рослинну олію ни похилого віку. та фосфоліпіди, до складу якого, відповідно до Поставлена задача вирішується пропоновавинаходу, додатково включені цистеїн та/або ліпоним способом визначення функціонального стану єва кислота, альфа-токоферол, бета-каротин, організму людини, що включає дослідження функспирт етиловий та вода, що у складі фосфоліпідціонального стану мононуклеарних клітин крові, за ного масложирового харчового продукту знахорезультатами якого судять про функціональний дяться у такому співвідношенні (мас.%): стан організму людини. Фосфоліпіди 8,35-20 Особливістю пропонованого способу визнаАльфа-токоферолу 0,016-1,5 чення функціонального стану організму людини є і Цистеїну та/або ліпоєвої кислоти 0,017-0,5 те, що під час дослідження функціонального стану Бета-каротину 0,015-0,035 мононуклеарних клітин крові оцінюють спроможСпирту етилового (96°) 15-20 ність клітин білої крові людини до адгезії. Олії рослинної 40-50 Особливістю пропонованого способу визнаВоди до 100. чення функціонального стану організму людини є і Особливістю пропонованого фосфоліпідного те, що під час дослідження функціонального стану масложирового харчового продукту є і те, що у мононуклеарних клітин крові визначають спромоякості фосфоліпідів використовують фосфоліпіди, жність клітин білої крові людини поглинати суспенотримані попередньою обробкою у воднозію пофарбованих фосфоліпідів. спиртовому розчині протягом 15-24 годин. Особливістю пропонованого способу визнаОсобливістю пропонованого фосфоліпідного чення функціонального стану організму людини є і масложирового харчового продукту є також і те, те, що під час дослідження функціонального стану що він має консистенцію емульсії. мононуклеарних клітин крові визначають метабоСуть пропонованих винаходів пояснюється лічну активність клітин білої крові людини МТТграфічними матеріалами, де: колориметричним методом. На Фіг.1 показано оцінку спроможності клітин Особливістю пропонованого способу визнабілої крові до адгезії по діаграмі, побудованій під чення функціонального стану організму людини є і час використання способу визначення функціонате, що під час дослідження функціонального стану льного стану організму людини. мононуклеарних клітин крові виконують оцінку поНа Фіг.2 показано оцінку спроможності клітин глинальної активності клітин білої крові людини білої крові людини поглинати суспензію пофарбо(фагоцитоз) із використанням культури Escherihia ваних фосфоліпідів по діаграмі, створеної за реcoli. зультатами дослідження спроможності клітин білої Особливістю пропонованого способу визнакрові людини поглинати суспензію пофарбованих чення функціонального стану організму людини є і фосфоліпідів побудовану під час використання те, що під час дослідження функціонального стану способу визначення функціонального стану оргамононуклеарних клітин крові виконують оцінку нізму людини. стану ДНК клітин білої крові людини за допомогою На Фіг.3 показано результати оцінки метаболіметода електрофореза поодиноких клітин (метода чної активності клітин білої крові по діаграмі, ствокомет). реної за результатами дослідження оцінки метаПоставлена задача вирішується і пропоноваболічної активності клітин білої крові МТТним способом нормалізації стан}' клітинних мемколориметричним методом, побудовану під час бран організму людини, що включає операції вивикористання способу визначення функціональнозначення функціонального стану організму людини го стану організму людини. шляхом оцінки стану клітинних мембран організму На Фіг.4 наведені результати оцінки фагоцитолюдини в залежності від функціонального стану за по поглинанню бактерій клітинами білої крові, мононуклеарних клітин крові, а у випадку незадовизначені під час використання способу визначенвільних показників функціонального стану мононуня функціонального стану організму людини. клеарних клітин крові людини для нормалізації На Фіг.5 наведені у вигляді діаграми результастану його клітинних мембран призначають фости визначення фагоцитарного індексу спектрофофоліпідний масложировий харчовий продукт, що тометричним методом, побудованої під час викомістить фосфоліпіди, альфа-токоферол, бетаристання способу визначення функціонального каротин, цистеїн та/або ліпоєву кислоту, рослинну стану організму людини. олію, спирт етиловий та воду у такому співвідноНа Фіг.6 наведені у вигляді діаграми результашенні (мас.%): ти оцінки стану ДНК в клітинах білої крові побудо 5 85349 6 вану під час використання способу визначення На Фіг.12 наведені результати оцінки фагоцифункціонального стану організму людини. тоза по поглинанню бактерій клітинами білої крові, На Фіг.7-16 показано зміни стану клітинних створеної під час застосування способу нормалімембран людини при застосуванні препарату зації стану клітинних мембран організму людини, ФМХП. Комплекс ФМХП був випробуваний на хвощо демонструють значне збільшення проценту рих похилого віку з основним діагнозом "паркинсофагоцитуючи х клітин у дослідних хворих після нізм". Для порівняння був досліджений один - "конприйому ФМХП, а у контрольного хворого він натрольний" - хворий похилого віку з основним віть зменшився. Ці дані свідчать про активацію діагнозом "паркинсонізм", який не приймав ФМХП. мембранних компонентів, що відповідають за такі Після отримання всіх результатів дослідження за етапи фагоцитарної реакції як захоплення й подопомогою вищеописаних методів, спостерігалося глинання чужорідного матеріалу, після прийому значне поліпшення по всім показникам у 80% хвоФМХП. рих. Для віз уального представлення отриманих На Фіг.13 наведені у вигляді діаграми резульрезультатів були відібрані хворі з характерними тати визначення фагоцитарного індексу спектропоказниками, а для порівняння взяті результати фотометричним методом, створеної під час застоконтрольного хворого П., який не приймав ФМХП. сування способу нормалізації стану клітинних На Фіг.7 показано оцінку спроможності клітин мембран організму людини. З Фіг.13 видно, що білої крові до адгезії по діаграмі, створеної за рефагоцитарний індекс (ФІ) у хворих, які приймали зультатами дослідження адгезії до і після прийому ФМХП, зріс в порівнянні з значенням на початку ФМХП під час застосування способу нормалізації досліду. У контрольного хворого ФІ також виріс за стану клітинних мембран організму людини. час досліду, що можна пояснити позитивним ефеЗ діаграми (Фіг.7) видно, що після прийому ктом спеціального лікування за діагнозом. Т.ч., ФМХП у досліджуваних хворих адгезивні властиспектрофотометричний метод дозволяє оцінити ФІ вості клітин значно посилились, як і у більшості в клінічній практиці. хворих, в той час як у контрольного хворого за час На Фіг.14 наведеш у вигляді діаграми резульдослідження цей показник практично не змінився. тати оцінки стану ДНК в клітинах білої крові, ствоНа Фіг.8 показано оцінку спроможності клітин реної під час застосування способу нормалізації білої крові пацієнта поглинати суспензію пофарбостану клітинних мембран організму людини. З ваних фосфоліпідів по діаграмі, створеної під час Фіг.14 видно, що після прийому ФМХП у дослідних застосування способу нормалізації стану клітинних хворих величина L/D знизилася, що свідчить про мембран організму людини. З діаграми видно, що загальну стабілізацію геному клітин. Зниження цієї після прийому ФМХП рівень світимості у всіх довеличини у контрольного хворого можна пояснити слідних хворих виріс майже в два рази, чого не тим, що хворий проходив курс моногенного базоможна сказати про контрольного хворого, який не вого лікування. приймав ФМХП. В цьому випадку рівень світимості Діаграми на Фіг.15-16 створені для оцінки стапрактично не змінився. ну ДНК в окремих клітинах для більш повної хараДіаграми, наведені Фіг.9 та 10, побудовані для ктеристики змін, які відбулися після прийому визначення розподілу клітин по поглинанню пофаФМХП хворими. рбованих ФЛ. На Фіг.15 наведені у вигляді графіка результаНа Фіг.9 показано рівень світимості клітин білої ти розподілення відношення L/D по клітинам у докрові хворого І. З Фіг.9 видно, що більшість клітин сліджуваного хворого І, створеного під час застокрові досліджуваного хворого І. перед вживанням сування способу нормалізації стану клітинних ФМХП має діапазон світимості від 150 до 200у.о., мембран організму людини. З Фіг.15 видно, що у тобто поглинала пофарбовані ФЛ з малою ефекхворого І. після прийому ФМХП кількість клітин з тивністю. Після прийому ФМХП хворим І. збільшинизьким співвідношенням L/D збільшилась, тобто лась кількість клітин з високим рівнем світимості відбулась стабілізація ДНК більшої частини попу(350-600у.о.), а значить ці клітини поглинають біляції клітин білої крові. В той же час у контрольнольше пофарбованих ФЛ. Ці дані говорять про пого хворого таких змін не спостерігали, що видно з ліпшення стану систем очистки організму, а з Фіг.16, де наведені у вигляді графіка результати Фіг.10, на якій показано рівень світимості клітин розподілення відношення L/D по клітинам у контбілої крові контрольного хворого видно, що у контрольного хворого П., створеного під час застосурольного пацієнта таких змін не відбулося. вання способу нормалізації стану клітинних мемНа Фіг.11 показано результати оцінки метабобран організму людини. лічної активності клітин білої крові, створеної під На Фіг.17 наведено фото клітин білої крові, що час застосування способу нормалізації стану клімістять пофарбовані фосфоліпіди, сфотогра фоватинних мембран організму людини, що демонструє ні в ультрафіолетови х променях. активність ферментів - мітохондріальних дегидроНа Фіг.18 наведено фото клітин білої крові, що геназ в клітинах білої крові по перетворенню розмістять пофарбовані фосфоліпіди сфотографовані чинного МТТ у нерозчинний формазан. Якщо порів видимій області. вняти метаболічну активність клітин білої крові На Фіг.19 наведено на фото пофарбовані фодослідних хворих до і після прийому ФМХП, то сфоліпіди, які являють собою жирові часточки видно, що активність мітохондріальних дегидрогерозміром від 0,1 до 1мкм, що в ультрафіолетових наз в клітинах білої крові збільшилась після припроменях люмінесцують жовтим світлом. йому ФМХП порівняно з контрольним хворим, у На Фіг.20 наведено на фото виготовлений якого метаболічна активність залишилась практипрепарат клітин білої крові після експозиції з почно на вихідному рівні. фарбованими фосфоліпідами та їх відмивання, у 7 85349 8 котрому ці клітини були механічно роздавлені сидантними властивостями у пропонованому про(сфотографовано в ультрафіолетових променях) дукті - це речовини, що затримують або для доказу процесу поглинання, а не адсорбції на уповільнюють розрив подвійних зв'язків в молекуповерхні клітин пофарбованих фосфоліпідів. лах поліненасичених жирних кислот та бетаНа Фіг.21 наведено на фото виготовлений каротину, та усувають окисні та перекисні сполуки препарат клітин білої крові після експозиції з поі переходять при цьому в нейтральну, нешкідливу фарбованими фосфоліпідами та їх відмивання, у для організму форму (як приклад, такими речовиякому ці клітини були механічно роздавлені (сфонами є цистеїн або ліпоєва кислота). тографовано в видимій області) для доказу процеВикористання пропонованих винаходів дозвосу поглинання, а не адсорбції на поверхні клітин ляє створити такий продукт, який би містив ессенпофарбованих фосфоліпідів. ціальні фосфоліпіди, компоненти захисту якого У зв'язку з погіршенням екологічної обстановки підібрані так, що вони, з одного боку, є природнита «старінням» населення України особливу актуми і фізіологічними, а з іншого боку - перспективальність одержують проблеми скринінгової оцінки і ними для протекторної дії не тільки при збережензасоби поліпшення стану організму людини. ні препарату фосфоліпідів, але й в організмі На сьогоднішній день ясно, що стан організму людини при споживанні цього продукту. Пропоноу визначальній мірі залежить, з одного боку, від ваний продукт сприяє зниженню інтенсивності стану мембран, а з іншого боку - від стану систем протікання процесів вільного радикального окисзахисту й очищення організму. лення, відновленню фосфоліпідного складу кліВластивості мембран багато в чому залежать тинних мембран, поліпшенню інтегральної діяльвід складу фракцій фосфоліпідів, жирних кислот та ності центральної нервової системи, поліпшенню їх похідних, а також від співвідношення фосфолітранспорту життєво важливих препаратів, що вжипіди-холестерин. Порушення мембранної структуваються, сприяє адекватній корекції порушеного ри клітин ведуть до різного ступеня відхилень мецеребрального й загального метаболізму. таболізму організму. Введення до складу продукту альфаОстаннім часом у клінічній практиці широко токоферолу і бета-каротина посилює біологічну застосовуються препарати ессенціальних фосфодію фосфоліпідів на організм людини. Присутність ліпідів для поліпшення функціонального стану і же цистеїну - фізіологічної амінокислоти - перекорекції складу мембран. Проте вадою таких прешкоджає швидкому окисленню поліненасичених паратів є те, що вони являють собою очищений жирних кислот, сприяє їхній стабілізації, значно індивідуальний або суміш очищених фосфоліпідів, підвищує ефективність продукту, що заявляється, і що після хімічної екстракції втрачають усі ті комдає всі підстави віднести цей момент до розряду поненти, що у живій клітині стабілізують мембрану, істотних. зупиняють або уповільнюють перекисне окислення Новий результат досягається внаслідок того, і «забирають» на себе шкідливі продукти окисленщо введений до складу ФМХП цистеїн, який в силу ня й інші форми деградації фосфоліпідів і, у першу своїх якостей може проявляти антиоксидантні чергу, поліненасичених жирних кислот, що входять властивості при наявності окислювача та відновдо їхнього складу (головним чином, линолевої і лювальні властивості в випадку окислення комполиноленової кислот). До того ж, такі препарати по нентів ФМХП. Таким чином, він запобігає руйнутим же причинам швидко втрачають термін придаванню подвійних зв'язків у поліненасичених тності. Фактично через півроку зберігання при темжирних кислот та інших сполук, знешкоджує окисні пературі +4°С ефективність фосфоліпідних препата перекисні речовини, що з'являються в препараратів значно знижується. ті, при цьому цистеїн переходить у нешкідливу для В даний час розроблено багато препаратів есорганізму форму - амінокислоту цистин. В резульсенціальних фосфоліпідів, що можуть використотаті, альфа-токоферол і бета-каротин посилюють вуватися як харчові добавки. Часто до їхнього дію поліненасичених жирних кислот, що містяться складу вводять антиоксиданти - бета-каротин і в комплексі ФМХП, виконуючи повною мірою роль альфа-токоферол. Бета-каротин як попередник вітамінів і антиоксидантів. Все це збільшує ефеквітаміну А і альфа-токоферол (вітамін Е) є також тивність дії ФМХП на організм людини. цінними компонентами таких препаратів. Проте, Новий результат досягається також внаслідок велика кількість ненасичених сполучених подвійтого, що введена до складу ФМХП ліпоєва кислоних зв'язків (11!) у молекулі каротину обумовлює та, яка проявляє подібно до цистеїну антиоксиданйого легке окислення, що, власне, і дозволяє йому тні властивості при наявності окислювача та відслугувати антиоксидантом, але при цьому бетановлювальні властивості в випадку окислення каротин втрачає корисні властивості провітаміну А. компонентів ФМХП. Цистеїн та ліпоєву кислоту при Те ж саме стосується альфа-токоферолу, окислеприготуванні продукту також можна використовуна форма якого не може слугува ти в організмі в вати разом у відповідних кількостях. А у випадках якості вітаміну. Крім того, продукти окислення цих індивідуальної чутливості до одного з ци х компоречовин шкідливі для організму. нентів, його виключають зі складу продукту. (ЦисЩоб захистити ці компоненти від окислення теїну - 0,26-0,4мас.%, а ліпоєвої кислоти 0,017потрібно ввести речовини, які мають відновні та 0,5). антиоксидантні властивості та відносяться до груСумісне використання цистеїну та ліпоєвої кипи фізіологічних та природних сполук. Ці речовини слоти розширює спектр їх дії як відновників і антидіють як антиоксиданти в присутності окислювача, оксидантів за рахунок того, що ці речовини встуа у випадку окислення корисних сполук відновлюпають в реакції з різними хімічними сполуками. ють їх. Речовини з відновлювальними та антиок 9 85349 10 Наступною складовою частиною ФМХП є роста поліненасичених жирних кислот. Це дало також линна олія з насіння соняшнику, виготовлена без можливість уникнути складних та енергомістких використання високих температур, методом «хотехнологічних операцій для екстракції фосоліпідів лодного» пресування. Олія, отримана по такій техз джерел, що їх містять. нології, характеризується низьким ступенем окисТаким чином, ФМХП складається з наступних лення жирних кислот, що знаходиться в ній, і після компонентів: введення до складу комплексу, є цінним додатковим джерелом природних поліненасичених жирних Таблиця 1 кислот, альфа-токоферола та бета-каротина. Крім вищезгаданих компонентів ФМХП, у його Склад ФМХП (у розрахунку на одну порцію) склад введений етиловий спирт (15-20мас.%) з метою поліпшення засвоювання препарату. ВідоКомпоненти Мас.% мо, що у багатьох людей, а здебільшого у людей 1. Фосфоліпіди 8,35-20 похилого віку .спостерігається погіршення засво2. Альфа-токоферол 0,016-1,15 єння харчових продуктів та лікарських засобів. 3. Цистеїн та/або ліпоєва кислота 0,017-0,5 Експериментально на тваринах було встановлено, 4. Бета-каротин 0,015-0,035 що етиловий спирт у кількості 15-20мас.% сприяє 5. Спирт етиловий (96°) 15-20 значному збільшенню усмоктування фосфоліпідів. 6. Рослина олія 40-50 Крім того, у малих дозах етиловий спирт є терапе7. Вода до 100 втичним продуктом · він стимулює утворення ліпопротеїдів високої щільності і, таким чином, покраСклад індивідуальних фосфоліпідів і поліненащує стан судинної системи. Етиловий спирт є сичених жирних кислот у препараті «Лецитин» перехоплювачем найбільш небезпечного для лю/виробник New Spirit Naturals, CA, USA ДЛЯ КОМдини гідроксильного радикала, тому що в організмі ПАНІЇ "Vita Max" Адреса: Москва 107014, абон. відсутні спеціалізовані системи його детоксикації. скринька №472/ наведений у таблиці 2. Етиловому спирту властиві тонізуючі й антисептичні властивості і т.д. Особливістю пропонованого Таблиця 2 ФМХП є і те, що фосфоліпіди перед вживанням мають набрякнути, а кінцевий продукт, що містить Компонент Вміст в порції (10г) мг всі компоненти, має консистенцію емульсії. Попе1. Фосфатидилхолін 22,2 редня підготовка фосфоліпідів перед вживанням 2. Фосфатидилетаноламін 19,3 включає набрякання фосфоліпідів у водноспирто3. Фосфатидилінозитол 13,5 вому розчині, що є необхідним етапом і поясню4. Лінолева кислота 25,5 ється тим, що до складу продукту введений спирт 5. Ліноленова кислота 3280 у вигляді водного розчину, який забезпечує значно 6. Фосфатиди 91,8 більш інтенсивне всмоктування ФМХП. Але фос7. Холін 3470 фоліпіди не розчиняються у водноспиртових сере8. Інозитол 2020 довищах, тому необхідно перевести їх у форму, 9. Калій 1060 яка б засвоювалася організмом. Щоб отримати фосфоліпіди в такій формі, їх піддавали набряканДля нормального існування організму також ню у водноспиртовому розчинні протягом 15-24 важливим є контроль за станом систем очищення. годин. За цей час фосфоліпіди переходили у форВиведення з організму низькомолекулярних прому гідратованого колоїда, яка значно краще задуктів життєдіяльності, як відомо, здійснюють нирсвоюється організмом. ки, а за очищення від високомолекулярних продукПодальше змішування фосфоліпідів, які підтів відповідають дві популяції клітин: гранулоцити, давали набряканню у водноспиртовому розчинні, з що циркулюють у крові, (мікрофагоцити) і тканинні рослинним маслом призводить до утворення емумакрофаги (1). льсії, основною частиною якої є, по суті, ліпосоми Моноцити і макрофаги створюють у кровотво(ліпо - жир, соми - тільця). Така форма, як відомо, рній системі унікальну клітинну лінію - систему зараз широко використовується в різних галузях мононуклеарних фагоцитів (С МФ) або макрофагамедицини, і є оптимальною та фізіологічною для льну систему. СМФ є центральною, що об'єднує споживання, тому що речовини у вигляді ліпосом різноманітні типи клітин, що беруть участь у захикраще засвоюються організмом. Крім того, пригосних реакціях організму. Макрофаги і моноцити тування кінцевої форми пропонованого продукту грають головну роль у звільненні організму від безпосередньо перед споживанням дає можлипродуктів деструкції власних тканин і клітин, що вість уникнути пошкодження компонентів продукту утворилися внаслідок старіння або ушкодження, в водному середовищі за рахунок утворення окисвідкладень фібрину, а також від генетично чужоріних, перекисних та інших шкідливих сполук при дних елементів: збудників інфекційних захворюдовготривалому їх контакту. Таким чином, ФМХП, вань, вірусінфікованих або пухлинних клітин і т.п. що заявляється, дозволяє розширити та збагатити [1]. асортимент біологічно активних продуктів, особлиТаким чином, контроль за станом систем очиво для людей зі зниженою здатністю до засвоєння щення організму від макромолекул і їх агрегатів, є та людей похилого віку. найважливішою теоретичною і практичною задаЯк приклад, в продукт ФМХП був введений чею. "ЛЕЦИТИН", як джерело стандартизованих, з опПри вивченні літератури методики, що дозвотимальним складом ессенціальних фосфоліпідів ляють оцінити спроможність клітин, що фагоциту 11 85349 12 ють, поглинати макромолекули і їх агрегати, не У розроблений спосіб визначення функціонабули знайдені. По літературним даним [1, 3, 4, 5] льного стану організму людини та спосіб нормалівикористовуються методики, що показують спрозації стану клітинних мембран організму людини можність до поглинання деякими видами клітин входять як цілком оригінальний новий метод кільлише корпускулярних часток. кісної оцінки функціонального стану клітин білої У якості об'єктів фагоцитоза використовуються крові по їх спроможності поглинати суспензію пояк суспензії мікробів, так і інертні частки (вугілля, фарбованих фосфоліпідів, так і вже існуючі метополістирол, крохмаль, латекс). До хиб цього методи, модифіковані нами для поставлених задач. ду можна віднести утруднення при дифференціюОпис методів, що використовують під час здійванні поглинених мікробів (часток) від адсорбоваснення способу оцінки функціонального стану орних на поверхні клітин, що фагоцитують. [5]. ганізму людини. Т.ч., розробка методів, що дозволяють визнаОдержання клітин білої крові та їх адгезія на чати функціональний стан клітин крові, дасть можскло: ливість не тільки об'єктивно оцінювати стан сисГоловною вимогою при одержанні клітин білої теми очищення організму, але буде слугува ти крові була умова, щоб клітини не піддавалися ефективним показником використання препаратів будь-яким впливам - ні фізичним, ні хімічним. У для нормалізації функцій організму, зокрема, презв'язку з цим, у якості антикоагулянта використопаратів, що впливають на стан мембран клітин. вували ЭДТА - нейтральний агент, а макрофагаПропоновані винаходи дозволили вирішити льні клітини фракціонували методом, що не зазадачу визначення функціонального стану моношкоджує - адгезією на скло. У таких умовах нуклеарних клітин крові людини та нормалізації одержані клітини крові є практично неушкодженистану клітинних мембран людини шляхом викорими. стання продукту, що містить ессенціальні фосфоМетод одержання клітин білої крові: ліпіди. - у людини відбирали 2мл крові в пробірку, що Основною функцією мононуклеарних фагоцимістить ЭДТА; тів крові є звільнення організму від вже не потріб- кров вносили у тонкі скляні трубочки з внутних продуктів деструкції власних тканин та клітин, рішнім діаметром 3-4мм і центрифугували в бакетвірусінфікованих та пухлинних клітин, а також від роторі 30 хвилин при 400g; потрапивших ззовні генетично чужорідних елемен- після видалення плазми, відбирали клітини тів - збудників інфекційних захворювань і т.і., а цей білої крові в парафіновану пробірку, що містить процес в першу чергу залежить від здатності фа1мл середовища RPMI -1640 із 5% ембріональної гоцитуючи х клітин поглинати всі вищеназвані струтелячої сироватки (етс); ктури. В свою чергу процес поглинання залежить - доводили щільність клітин середовищем до від стану клітинних мембран мононуклеарних фа5´105-2´106 у мл (такі клітини використовували гоцитів, для переробки поглинутого матеріалу подля адгезії на пластик, для визначення метаболічтрібна ефективна робота ферментів, а все це заної активності, для оцінки поглинання бактерій безпечується нормальним станом геному клітини. спектрофотометричним методом, та для метода Пропонований спосіб визначення функціонаелектрофореза поодиноких клітин (метода комет); льного стану мононуклеарних клітин дозволяє ви- 100мкл клітин наносили на предметне скло і значити стан їх клітинних мембран по здатності до проводили адгезію при 37°С 40 хвилин у вологій адгезії та поглинання пофарбованих фосфоліпідів камері; та живих бактерій, оцінювати ефективність роботи - адгезованні клітини відмивали від еритроциферментів на прикладі мітихондріальних дегідротів і клітин, що не сіли на скло, середовищем геназ, а також визначати ступінь стабільності геRPMI-1640 із 5% етс (100мкл); ному по стану ДНК в клітинах. - на адгезованні клітини наносили 100мкл сеОскільки мононуклеарні фагоцити є представредовища RPMI-1640 із 5% етс. Клітини крові в никами клітин організму та є важливою частиною такому вигляді використовували для поглинання систем його очищення й захисту, то функціональпофарбованих фосфоліпідів та бактеріальних кліний стан цих клітин є критерієм стану всіх клітинтин (цитохімічний метод). них мембран організму та систем його очищення 1. Ме тод адгезії клітин білої крові на пластик. та захисту. Спосіб визначення функціонального Під адгезивними властивостями клітини розустану організму людини включає такі операції: міють комплекс її характеристик, що визначає 1. Оцінка спроможності клітин білої крові люспроможність клітини встановлювати і підтримувадини до адгезії; ти контакти з іншими клітинами і/або неживим суб2. Оцінка спроможності клітин білої крові люстратом. Адгезія обумовлена експресією на мемдини поглинати суспензію пофарбованих фосфобранах клітин спеціальних адгезивних молекул, ліпідів що відповідають не тільки за щільний міжклітинний 3. МТТ-колориметричний метод визначення контакт, але і за його специфічність. метаболічної активності клітин білої крові людини У організмі адгезивність клітин, що фагоцитупо активності мітохондріальних дегідрогеназ; ють, грає важливу роль у момент виходу цих клі4. Оцінка поглинальної активності клітин білої тин із кровоносного русла в тканини, а також у крові людини (фагоцитоз) із використанням кульпроцесі їхнього проникнення в осередки запалентури Escherihia coli. ня. Розвиток інфекційного процесу і формування 5.Електрофорез поодиноких клітин білої крові імунної відповіді, а також неспецифічна елімінація людини (метод комет) для оцінки стану ДНК у цих різних часток багато в чому також залежать від клітинах. 13 85349 14 перших фаз взаємодії макрофагальних клітин із піди (Фіг.21), тобто не дають внесок світимості при чужорідним агентом. оцінці поглинальної активності мононуклеарних Таким чином, ступінь адгезії клітин білої крові клітин крові. характеризує ступінь готовності клітин до захисту Запропонований метод простий у постановці, організму. Проведення аналізу: дозволяє швидко протестувати велику кількість - отримані вищеописаним способом клітини зразків крові, дає кількісну характеристику фагоцибілої крові розводили середовищем до концентратарної активності клітин білої крові, а виходить, дозволяє оцінювати стан цитоплазматичних мемції від 5´105 до 2´106 клітин у мл; бран організму. Всі ці якості дозволяють викорис- у лунку плоскодонного стрипа (Titertek, Фінтовувати запропоновану методику в клінічній пракляндія), попередньо обробленого 0,01N НСl, а тиці. потім відмитого і висушеного, вносили 100мкл кліМетодика проведення аналізу. тин і проводили адгезію при 37° С продовж 40 хвилин; 2.1. Готування пофарбованих фосфоліпідів. - у еппендороф вносили 100мкл спиртового - адгезовані клітини відмивали від еритроцитів розчину фосфоліпідів із концентрацією 25мг у мл; і клітин, що не прикріпилися, середовищем RPMI- у цей же еппендорф вносили 1мкл 1% спир1640 (2 рази по 200мкл); тового розчину родамину Ж, перемішували; - стрип з адгезованими клітинами залишали при кімнатній температурі до висихання; - серією двократних розведень у 0,14Μ NaCl розводили вихідний розчин фосфоліпідів із фар- клітини фіксували і фарбували по Романовбою в 16 разів (важливо - при внесенні пофарбоського-Гимза-Май-Грюнвальду 15 хвилин; ваних фосфоліпідів у фізіологічний розчин при - фарбу відмивали і клітини переглядали під розведеннях обов'язково старанно ресуспендувамікроскопом (збільшення ´10); ти суміш на потужному міксері протягом 20 се- зображення переводили на екран монітора кунд); комп'ютера і, використовуючи комп'ютерні програ- пофарбовані фосфоліпіди 3 рази відмивали ми Image Master VDS (каталог компанії - Amersham від фарби центрифугуванням по 0,5мл фізіологічPharmacia Biotech Export, USA, видавництво ного розчину; Denmark, Stibo Graphic, 1999), підраховували кіль- після останнього відмивання до осаду пофакість клітин у 10 полях зору; рбованих фосфоліпідів додавали 50мкл - розрахувавши площу поля зору в комп'ютері і фіз.розчину і старанно ресуспендували на міксері площу лунки стрипа і визначивши середню кіль20 секунд. Отриманий розчин пофарбованих фокість клітин в однім полі зору, розраховували кільсфоліпідів використовували для аналізу поглинакість адгезованих клітин у лунці. льної активності клітин білої крові. 2. Метод поглинання клітинами білої крові по2.2. Методика поглинання пофарбованих фофарбованих фосфоліпідів. сфоліпідів клітинами білої крові. Запропонований метод є оригінальною розро- до адгезованих на склі клітин (див. метод бкою і грунтується на тому, що в результаті спеодержання клітин білої крові) додавали 10мкл поцифічного фагоцитозу клітини білої крові поглинафарбованих фосфоліпідів; ють пофарбовані родамином Ж фосфоліпіди. - проводили інкубацію препарату 40 хвилин Фосфоліпіди в даному методі слугують моделлю при температурі 37° С у вологій камері; «сміття», що клітини, які фагоцитують, елімінують - відмивали фосфоліпіди, що не зв'язалися з в організмі людини. Приєднання часток до клітин, клітинами, промиванням середовищем RPMI-1640 що фагоцитують, викликає якісні зміни структурних (2 рази по 250мкл), нахиливши скло; компонентів цитоплазматичної мембрани, які при- накривали препарат покривним склом і незводять до посилення всіх етапів фагоцитарної гайно враховували результати під люмінесцентреакції, у тому числі, прикріплення і поглинання. ним мікроскопом (масляна іммерсія, збільшення Ступінь поглинання пофарбованих фосфоліпідів 90, фільтр 2, фільтр ФС) із підключенням кольорооцінюється кількісно по інтенсивності світіння клівої відеокамери і комп'ютера. Використовуючи тин білої крові людини в ультрафіолетових промепрограми Image Master VDS (каталог компанії нях. Клітини білої крові, що не містять пофарбоваAmersham Pharmacia Biotech Export, USA, видавні фосфоліпіди, у цих умовах не світяться (Фіг.17ництво -Denmark, Stibo Graphic, 1999), робили кі18). лькісні виміри світності клітин (50-100 клітин). НоПофарбовані фосфоліпіди являють собою жирмою світності слугували величини, отримані на рові часточки розміром від 0,1 до 1мкм, що в ультздорових людях (донорах). Зростання величини рафіолетових променях люмінесцують жовтим світності та збільшення кількості клітин з великою світлом (Фіг.19). світності після курсу лікування або профілактичноДля доказу факту фагоцитозу, а не адсорбції го прийому мембраностабілізуючих препаратів, фосфоліпідів на поверхні мононуклеарних клітин, свідчить про зростання поглинальної активності був ви готовлений препарат клітин білої крові після клітин крові. експозиції з пофарбованими фосфоліпідами, у 3. Визначення метаболічної активності клітин котрому ці клітини були механічно роздавлені. білої крові Було показано, що частки фосфоліпідів знахоМетод описаний у літературі і заснований на дяться тільки в матеріалі, який вийшов із клітин у перетворенні розчинного МТТ (3 4,5результаті їхньої руйнації (Фіг.20). диметилтіазол-2-іл-2,5-дифенілтетразолія бромид) Оскільки препарати клітин білої крові містять у нерозчинну пофарбовану форму (формазан) деяку кількість еритроцитів, було показано, що активними мітохондріальними дегидрогеназами еритроцити не адсорбують пофарбовані фосфолі 15 85349 16 живих клітин. Формазан потім може бути розчинерофагальними клітинами. Метод полягає в тому, ний в органічних розчинниках і ступінь фарбування що клітини бактерій (у нашому випадку E. Соlі) обмірювана спектрофотометрично. Рівень оптичобробляють МТТ і інкубують 30 хвилин при темпеного поглинання є кількісною оцінкою метаболічної ратурі 37°С. За цей час у клітинах бактерій з'являактивності досліджуваних клітин. ються пофарбовані формазаном структури (фото), Авторами метод був відпрацьований для кліпісля чого їх додають до клітин білої крові. Після тин білої крові; підібрані оптимальні умови його розчинення формазана при додаванні ДМСО, запроведення і показано, що метод може бути викоміряють оптичну щільність отриманого розчину, ристаний у клінічній оцінці фізіологічного стану величина якої пропорційна кількості поглинених клітин білої крові в процесі лікування. бактерій. По калібровочній кривій визначають кільМетодика проведення аналізу. кість бактеріальних клітин і, прив'язавши ці цифри - для аналізу використовували свіжовиділені до відсотка клітин, що фагоцитують, (який одерклітини периферичної крові людини (див. метод жують за допомогою цитохімічного методу), можна отримання клітин білої крові); визначити фагоцитарний індекс - кількість погли- у лунку плоскодонного стрипа (Titertek, Фіннених бактерій однією макрофагальною клітиною ляндія), попередньо обробленого 0,01N HCL, від(у середньому). митого від кислоти і висушеного, вносили 100мкл Цей метод простий і зручний, дозволяє швидсуспензії клітин білої крові з концентрацією від ко оцінити велику кількість проб. Постановка методики: 5´105 до 2´10б у мл; 4.1. Обробка бактеріальних клітин МТТ: - проводили адгезію 40 хвилин при температу- клітини Е. Соlі, штамм ДН 10В вирощували в рі 37°С в атмосфері 5%-ного СО2; рідкому середовищі LB при 37° С до оптичної - відмивали адгезовані клітини від еритроцитів і клітин, що не прикріпилися; щільності 1 ( концентрація мікробних часток 1´106 - вносили в лунку 100мкл свіжого середовища у мл); RPMI-1640, що містить 5% етс і 10мкл робочого - у 1мл бактеріальних клітин вносили 50мкл розчину МТТ у концентрації 5мг у мл; МТТ (5мг у мл) і експонували 30 хвилин при 37° С - проводили інкубацію 15 годин в умовах протягом 30 хвилин; 100%-ної вологості в атмосфері 5%-ного СО2 при клітини бактерій тричі відмивали 37°С; фіз.розчином і отриманий після третього відми- візуально переконувалися в наявності ліловання осад ресуспендували в середовищі RPMIвих кристалів формазана; 1640; - із лунки видаляли середовище і додавали - отримані пофарбовані формазаном бактерії 200мкл ДМСО (диметилсульфоксид, «Мирандавикористовували для визначення відсотка клітин С») для розчинення формазана, що утворився; білої крові, що фагоцитують, (цитохімічний метод) і - через 10 хвилин інкубації при кімнатній темвизначали фагоцитарний індекс (спектрофотометпературі відбувається повне розчинення кристалів ричний метод). формазана. Заміряли оптичну щільність (ОЩ) вмі4.2. Цитохімічний метод визначення клітин бісту лунок за допомогою мультилуночного спектлої крові, що фа гоцитують. рофотометра (Titertek Multiskan MCC 340) при до- проводили адгезію клітин білої крові на скло вжинах хвиль 540нм і 690нм. Враховували різницю як описано в методиці одержання клітин білої кропоглинання при довжині хвилі 540нм і фонового ві; значення ОП при 690нм. - до клітин, що знаходяться в живильному се4. Визначення бактерицидної активності клітин редовищі додавали 10мкл суспензії пофарбованих білої крові. формазаном бактерій (див. метод 5.1) і експонуОднією з головних захисних функцій клітин вали 40 хвилин у водонасиченій атмосфері, що макрофагальної системи є поглинання і знищення містить 5% вуглекислого газу при 37°С; мікроорганізмів, що потрапили до організму. Ця - клітини двічі відмивали живильним середофункція опосередковується численними ефекторвищем від бактерій, що не були поглинуті; ними молекулами, що генеруються макрофагаль- препарат висушували на повітрі при кімнатній ними клітинами, що у функціональному відношенні температурі до повного висихання; проявляється посиленням їх фагоцитарної, цито- висушений препарат фіксували і фарбували токсичної, мікробицидної активності. по Романовському-Гимза протягом 15 хвилин; Т.ч., ефективність поглинання бактерій кліти- висушений після фарбування препарат мікнами білої крові може служити важливим показнироскопували і підраховували відсоток клітин, що ком активності захисних систем організму. містять пофарбовані бактерії, стосовно загального Бактерицидну активність клітин білої крові дочисла підрахованих фагоцитів. сліджували цитохімічним і спектрофотометричним 4.3. Спектрофотометричне визначення фагометодами. цитарного індексу. Цитохімічний метод дозволяє оцінити кількість - для постановки методу використовували 12клітин, що фагоцитують, він застосовується в лати лункові стрипи фірми Titertek (Фінляндія), попебораторній і клінічної практиках також для визнаредньо оброблені як описано вище (методика 4); чення фагоцитарного індексу, тобто, кількості попроводили адгезію і відмивання клітин білої крові глинених мікробів на один макрофаг. як описано (методика 1) у двох повторностях - в Авторами був розроблений спектрофотометодній клітини були пофарбовані по Романовськоричний метод, що також дозволяє кількісно оціниго-Гимза і використанні для підрахунку загальної ти ступінь поглинання бактеріальних клітин маккількості клітин у лунці (див. методику 1), а друга 17 85349 18 власне для спектрофотометричного визначення - ЕДТА - 1ммоль фагоцитарного індексу. - SDS - 1%, pH7,5 - до клітин другого варіанта вносили 10мкл - агароза 0,5% (Pharmacia), виготовлена на пофарбованих формазаном бактерій. У контрольні 0,5-кратному ТБЕ; лунки вносили таку ж кількість живильного сере- низькоплавка агароза 1% (Sigma), виготовдовища; лена на 0,5-кратному ТБЕ; - стрипи інкубували при 37°С в водонасиченій - фарба - акридіновий жовтогарячий (2мкг/мл атмосфері, що містить 5% СО2 протягом 40 хвидист.води). лин; Хід роботи: - пластикова форма потрібного - після інкубації клітини 5 разів відмивали від розміру (у нашій роботі 6´8см), висотою 3мм запонепоглинених бактерій фіз.розчином; внювалася розплавленою 0,5%-ной агарозою; - у кожну лунку вносили по 200мкл ДМСО і ви- до затвердіння агарози на її поверхню опустримували 15 хвилин при кімнатній температурі кали покривні стекла (для утворення заглиблень для повного розчинення кристалів формазана; кишень). - проводили вимір оптичної щільності вмісту - після затвердіння агарози знімали покривні лунок за допомогою мультилункового спектрофостекла пінцетом; тометра при довжині хвилі 540нм; - 25-30мкл суспензії клітин білої крові (щіль- по калібровочній кривій залежності оптичної ність від 5´105до 2´106 на 1мл) ресуспендували у щільності від кількості бактеріальних клітин визнанизькоплавкій агарозі (1:1) (температура розплавчали кількість бактерій, поглинених макрофагальленої агарози +370-40°С); ними клітинами, у лунці. Знаючи загальну кількість - вносили суспензію клітин в агарозі (50мкл) у клітин білої крові в лунці і відсоток клітин білої кишені, що утворилися у пластиковій формі і накрові, що фагоцитують, (препарат пофарбованих кривали покривним склом. Починаючи з цього етаклітин на склі) підраховували кількість клітин, що пу всі операції проводили в затемненому місці; фагоцитують, у лунці, а значить і середнє число - після затвердіння агарози покривне скло акубактерій, поглинених одним фагоцитом - фагоциратно знімали і наносили на клітини буфер, що тарний індекс. лізує, (50мкл на одну кишеню з клітинами). Час 5. Електрофорез поодиноких клітин білої крові лізису - 5 хвилин для клітин білої крові (час лізису (метод ДНК-комет (ракет)). підбирається для кожного типу клітин); Впродовж життя в геномі організму людини - після лізису змивали буфер, що лізує, одним відбувається накопичення ДНК, які мають пошкомл електрофоретичного буфера (0,5-кратним); дження, викликані різними несприятливими фак- у камеру для електрофорезу з 0,5-кратним торами (стресами, погана екологія, куріння та ін.). електрофоретичного буфером розміщували пласОдним з показників нестабільності геному клітин тикову форму з лізованими клітинами в агарозі людини є деформація ядра клітини в цілому та таким чином, щоб буфер цілком покрив клітини; рухливість її ДНК в електричному полі. Існує метод - проводили електрофорез при 80V протягом 9 електрофорезу поодиноких клітин (метод комет), хвилин; який дозволяє якісно та кількісно визначити сту- виймали пластикову форму з камери, нанопінь пошкодження ДНК на рівні індивідуальної клісили на слайд водяний розчин акридинового жовтини. Цей метод був модифікований нами для оцітогарячого й фарбували ДНК протягом 6 хвилин; нки стану ДНК в клітинах білої крові людини. - препарати промивали 1-2мл електрофоретиМетод гр унтується на електрофорезі поодиночного буфера, скальпелем вирізали ділянку агароких (відособлених) лизованих клітин у постійному зи, що містить клітини, переносили її на предметне електричному полі. Після фарбування аналізуєтьскло. ся геном клітин, поданий у вигляді електрофоре- накривали слайд покривним склом і мікротичного сліду в гелі у формі комети (ракети), довскопували на мікроскопі в УФ-світлі; жина і щільність котрого, а також співвідношення з - для аналізу отриманих результатів за допорозміром ядра, залежать від ступеня стабільності могою відеокамери передавали зображення на ДНК. Відсутність або невеликий розмір електрокомп'ютер для наступного опрацювання по профоретичного сліду в гелі (як у здорової людини) грамам Image Master VDS (каталог компанії свідчить про стабільний стан ДНК, збільшення всіх Amersham Pharmacia Biotech Export, USA, видавдосліджуваних показників говорить про руйнуванництво - Denmark, Stibo Graphic, 1999), за допомоня або нестабільність ДНК. гою яких робили виміри довжини електрофоретичЦі дані с оцінкою ступеня структурних змін геного сліду (L) в гелі у формі комети (ракети) та ному клітин організму та можуть слугувати клінічдіаметру ядра (D) в середньому у 100 клітин. ним тестом стану організму й ефективності провеОтриманні за допомогою програми дані по довжині деного лікування. та щільності електрофоретичного сліду в гелі у Методика проведення аналізу формі комети (ракети), діаметру ядра, а також їх Використовувані реактиви і розчини: співвідношення, які характеризують ступінь стабі- электрофоретичний буфер ТБЕ (0,5-кратний) льності ДНК, порівнювались до та після лікування - готують 10-кратний розчин у пацієнтів, а також з показниками здорової людиТРИС-НСL - 108г/л; ни. БОРНА КИСЛОТА - 55г/л; Приклад. За описаною вище методикою виЕДТА 0,5 М - 4мл значали функціональний стан мембран клітин кро- буфер, що лізує: ві людини (донора). При цьому виконували такі - ТРИС-НСl - 10ммоль операції: досліджували кров здорової людини 19 85349 20 донора, а саме, оцінювали спроможність клітин На Фіг.5 наведені у вигляді діаграми результабілої крові людини до адгезії, спроможність клітин ти визначення фагоцитарного індексу спектрофобілої крові людини поглинати суспензію пофарботометричним методом чотирьох пацієнтів. ваних фосфоліпідів, визначали метаболічну актиПри порівнянні діаграм з Фіг.4 і Фіг.5 видно, що вність клітин білої крові людини МТТзастосування цих двох показників дає більш об'єкколориметричним методом, оцінювали поглинальтивну картину бактерицидної активності клітин ну активність клітин білої крові людини (фагоцибілої крові. Наприклад, у пацієнта П. більше 50% тоз) із використанням культури Escherihia coli, елеклітин є фагоцитуючим, а у пацієнта С. їх значно ктрофорезу поодиноких клітин білої крові людини менше, але кількість поглинути х бактерій однією для оцінки стану ДНК у ци х клітинах. Потім за тими фагоцитуючою клітиною однакова. Тобто, викориж методиками виконували дослідження крові пацістання цих двох методів дає більш повну характеєнтів - хворих похилого віку з основним діагнозом ристику стану макрофагальних клітин, а значить, і "паркінсонізм". На основі порівняння одержаних, стану захисних систем організму людини. згаданих вище, показників крові донора і пацієнта На Фіг.6 наведені у вигляді діаграми результаоцінювали стан клітинних мембран пацієнта. Оцінти оцінки стану ДНК в клітинах білої крові по відку метаболічної активності та фагоцитозу наведеношенню довжини електрофоретичного сліду ДНК но як приклади визначення цих показників у паціє(комети) до діаметру ядра (L/D) у здорового дононтів до лікування, як вихідних даних для ра та чотирьох пацієнтів похилого віку з основним порівняння з ними показників, отриманих в процесі діагнозом "Паркінсонізм". З діаграми видно, що у та після лікування. здорового донора співвідношення L/D становить На Фіг.1 показано оцінку спроможності клітин незначну величину, а у пацієнтів цей показник знабілої крові до адгезії по діаграмі, створеній за речно вищий. Це свідчить про стабільний стан ДНК в зультатами аналізу крові здорового донора та чоклітинах крові донора і про різного рівня дестабілітирьох пацієнтів з основним діагнозом "паркінсозацію ДНК у досліджуваних пацієнтів. Таким чинізм". Із діаграми (Фіг.1) видно, що спроможність ном, пропоновані методи оцінки функціонального клітин крові до адгезії у хворих значно нижча ніж стану клітин білої крові людини можуть бути рекоспроможність клітин крові до адгезії у здорового мендовані в клінічній практиці як прості, швидкі та донора. інформативні для визначення функціонального На Фіг.2 показано оцінку поглинання клітинами стану організму людини, відслідковування ходу та білої крові суспензії пофарбованих фосфоліпідів оцінки ефективності проведеного лікування. по діаграмі, створеної за результатами дослідженПриклад виготовлення пропонованого ФМХП: ня спроможності клітин білої крові здорового доСпосіб виготовлення пропонованого ФМХП нора та чотирьох пацієнтів похилого віку з основскладається з двох етапів. На першому етапі фоним діагнозом "паркінсонізм", поглинати суспензію сфоліпіди, наприклад препарат "Лецитин", залипофарбованих фосфоліпідів. Із діаграми (Фіг.2) вали водоспиртовим розчином цистеїну та витривидно, що рівень світимості клітин крові у хворих мували 15-24 годин у темному місці при кімнатній значно нижчий у порівнянні із здоровим донором, температурі. Цей етап потрібний для набрякання що означає, що клітини крові хворих значно гірше фосфоліпідів, які як відомо, не розчиняються у поглинають пофарбовані фосфоліпіди ніж клітини водних розчинах. Така попередня підготовка фосздорового донора. На основі цих даних можна фоліпідів є суттєвим моментом приготування зробити висновок, що захисні функції клітин крові у ФМХП, тому що при цьому фосфоліпіди у повній досліджуваних пацієнтів ослаблені. мірі стають досяжними для засвоєння організмом. На Фіг.3 показано у вигляді діаграми результаНа другому етапі отримують однорідну сути оцінки метаболічної активності клітин білої крові спензію шляхом різкого короткочасного взбовтучотирьох пацієнтів з діагнозом "Паркінсонізм", вання всіх компонентів ФМХП. При цьому фактичстворених на основі результатів по перетворенню но утворюються ліпосоми - жирові часточки (ліпо клітинами крові розчинного МТТ в нерозчинну пожир; соми - тільця), які значно краще засвоюються фарбовану форму (формазан), і що характеризуорганізмом ніж фосфоліпіди в іншій формі. ють активність мітохондріальних дегідрогеназ. З А саме: Фіг.3 видно, що метаболічна активність клітин білої - 10г "Лецитину" - джерело фосфоліпідів- внокрові у кожної людини різна, тобто виміри метабосили у ємність об'ємом 100мл; лічної активності клітин білої крові до прийому ліків - в іншу ємність вносили 100-150мг цистеїну, або інших препаратів треба вважати вихідною везаливали 15мл дистильованої або кип'яченої холичиною. Досліджуючи ці показники після лікуванлодної води, збовтували до повного розчинення ня можна оцінити вплив лікувальних заходів. Тобцистеїну; то, результати даного способу дають змогу - в отриманий розчин цистеїну вливали 10мл швидко та ефективно визначити ступінь метаболі96%-ного етилового спирту і отриманий продукт чної активності клітин крові пацієнтів та вплив ліперемішували до отримання прозорого розчину; кування на організм по цьому показнику. - вливали отриманий спиртовий розчин цистеНа Фіг.4 наведені у вигляді діаграми результаїну до ємності з лецитином, обережно коловими ти оцінки фагоцитозу по поглинанню бактерій клірухами перемішували вміст, закривали і залишали тинами білої крові чотирьох пацієнтів та вираженої ємність у темному місці при кімнатній температурі в (%) фагоцитуючи х клітин. З Фіг.4 видно, що ріна 15-24 годин для набрякання лецитину; вень фагоцитозу у пацієнтів відрізняється, тобто є - після набрякання "Лецитину" в ємність із леіндивідуальні відмінності цього показника, які явцитином додавали рівний їм об'єм - 30-35мл соляють собою вихідну величину до лікування. 21 85349 22 няшникової олії, що містила альфа-токоферол, вся фон настрою, зменшилося тремтіння кінцівок бета-каротин і цистеїн (див. табл. 1); та загальна скованість. - щільно закривали ємність і енергійно струПриклад 3: Хворий П., 63 роки, діагноз - хвошували її протягом 1-2 хвилини до одержання одроба Паркінсона, хворіє 2 роки, Приймав фосфонорідної суспензії; ліпідний масложировий харчовий продукт 14 днів - призначали пацієнту випити отриманий пренатщесерце. В результаті нормалізувлися і навіть парат натщесерце. Призначали приймати отримаполіпшилися показники стану та обміну ліпідів в ний препарат 30 днів із 5-ти денними перервами крові, зменшився вміст загального холестерину (з між декадами. 5,25мм/л до 4,75мм/л), в два рази збільшилося Приклади застосування ФМХП на хворих: співвідношення "холесгирин-ліпопротеїн високої Приклад 1: Хворий І., 66 років, перебував на щільності", в 1,5 рази знизився коефіцієнт агерозлікуванні в клініці Інституту геронтології МОЗУ з ності. Крім того, нормалізувався артеріальний тиск діагнозом "хвороба Паркінсона", якою хворіє де(від 107/75 до 120/80), покращилися показники в'ять років з супутнім захворюванням на цукровий стану притаманні хворобі "Паркинсона", а саме, діабет ll типу та на гіпертонію. Приймав ФМХП 14 зменшилась амплітуда тремора, покращилась днів натщесерце, у цей же період проводилось пластичність рухів. лікування по головному захворюванню (хвороба Приклад 4: Пропонований фосфоліпідний маПаркінсона). В результаті у хворого в крові знизивсложировий харчовий продукт (ФМХП) був випрося коефіцієнт атерогенності з 6,0 до 4,7, знизився буваний на хворих похилого віку з основним діагзагальний вміст холестерину, поліпшилося співнозом "паркінсонізм". Для цього були взяті дев'ять відношення холестерин - ліпопротеїди високої хворих, віком від 52 до 77 років, які приймали щільності. Дані показники говорять про нормалізаФМХП натщесерце протягом 14 днів. Для порівцію і навіть поліпшення стану та обміну ліпідів та няння був досліджений один хворий, який не приліпопротеїнів крові. Окрім сказаного, у хворого І. ймав ФМХП. В результаті дослідження за допомоспостерігалося зниження вмісту цукру у крові з гою вищеописаного способу було виявлено 6,2ммоль/1 до 5,3ммоль/1; нормалізувався кров'яочевидне поліпшення по всім досліджуваним поканий тиск з 170/100 до 120/90, покращилася постазникам у 80% хвори х (див. Фіг.6-15). ва, темп рухів, старт-рефлекс, підвищився емоційЛітература ний фон. 1. Козинец Г.И., Макарова В. А. Исследование Приклад 2: Хворий Г., 63 роки, хворіє на хвосистеми крови в клинической практике. - Μ.: Изробу Паркінсона 3 роки. Приймав фосфоліпідний дат-во Триада-Х. - С.480, 1997. масложировий харчовий продукт 14 днів натщесе2. Спивак Н.Я., Лазаренко Л.Н., Ми хайленко О.Н. рце, паралельно проводився курс лікування за Интерферон і система мононуклеарных фагоцидіагнозом. Після прийому фосфоліпідного маслотов. - Киев: Издат-во "Фитосоциоцентр", 2002 жирового харчового продукту у хворого Г. нормаС.163. лізувалися і навіть поліпшилися показники стану 3. Козинец Г.И. Інтерпретация анализов крови и та обміну ліпідів крові, зменшився вміст загального мочи и их клиническое значение. - М.:Триада-Х, холестерину в 1,3 рази, зменшився коефіцієнт 1998 - С. 104. атерогенності в 1,65 рази, зменшився вміст в крові 4. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран. - Ленипродуктів окислення ліпідів. Крім того, покращилинград: "Наука" - 1981. - С.339. ся показники симптомів хвороби Паркінсона, а 5. Алмазов В.А. Физиология лейкоцитов человека. саме зменшилося шаркання при ходінні, покращиЛенинград.: Издат-во "Наука". 1979. - С.205. 23 85349 24 25 85349 26 27 85349 28 29 85349 30 31 85349 32 33 85349 34 35 85349 36 37 Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 85349 Підписне 38 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601