Спосіб моделювання поверхневих рецепторів лімфоцитів

Спосіб моделювання поверхневих рецепторів лімфоцитів, який включає інкубування in vitro по Винахід відноситься до галузей біологи та медицини та може бути використаний для фармакологічного моделювання функціональної активності лімфоцитів периферійної крові Поверхневий рецепторний апарат, найбільш поширений у лімфоцитів, [Петров Р В, Хаитов Р М , Атауллаханов Р И Иммуногенетика и искусственные антигены М Медицина, 1983 —256 с ] забезпечує необхідний рівень ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ, МОЖЛИВІСТЬ ВІДПОВІДІ на ЗОВНІШНІ подразники, та в цілому відображає функціональний стан клітини Зміна КІЛЬКОСТІ та стану поверхневих рецепторів лімфоцитів можлива не тільки під час імунної ВІДПОВІДІ, але й може стати результатом впливу різних речовин ендогенного або екзогенного походження [Иммунология / Под ред У Пола — М , 1987 — т і ] ВІДОМІ способи зміни експресії поверхневих рецепторів лімфоцитів під дією низькомолекулярних пептидних комплексів, таких, яктімалін [Морозов В Г , Хавинсон В X , Писарев О А Выделение из тимуса и изучение природы фактора, стимулирующего иммуногенез // Докл АН СССР — 1977 — т 233, № 3 — С 491 - 494], БІЛОН [Сизоненко В А , Варфоломеев А Р Биорегулирующая терапия при термической травме / Чита Поиск, 1999 — 159 с ] , епіталамш [Загородняя Э Д Применение цитомединов в акушерско-гинекологической практике // Роль пептидных биорегуляторов (цитомединов) в регуляции гомеостаза Л , 1987 — С 38 - 39 Загородняя Э Д Коррекция нарушений иммунитета и гемостаза при гестозах препаратами эпифиза // Пептидные биорегуляторы - цито передньо відмитих лімфоцитів з пептидним екстрактом та оцінку його впливу на лімфоцити, який відрізняється тим, що як пептидний екстракт використовують пептидний екстракт паренхиматозного органа з широким спектром біологічної активності, а вплив оцінюють за зміною характеру експресії поверхневих рецепторів лімфоцитів за допомогою моноклональних антитіл медины С-П , 1992 — С 61 -62] Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб моделювання поверхневих рецепторів лімфоцитів, що включає інкубування in vitro попередньо відмитих 0,5% гідролізатом лактальбуміна в розчині Хенкса лімфоцитів з пептидним екстрактом кісткового мозку (МІЄЛОПІДОМ) у співвідношенні 40, 80 та 160мкг на 3 х 106 лімфоцитів Інкубування проводили в пластмасових пробірках фірми "Falcon" 0,5 годин при 37°С, 0,5 годин при 4°С та 18 годин при 4°С Після інкубування проби відмивали холодним гідролізатом лактальбуміна і ставили реакцію імунофлюоресценцм або розеткоутворювання з мишачими еритроцитами [Г П Маркова Сравнительное изучение влияния миелопида и тактивина на рецепторы В-клеток // Иммунология — 1995 — №1 — С 59-61] Недоліками існуючого способу є використання пептидного екстракту, отриманого із кісткового мозку, що потребує різних умов інкубації, що не дає можливості врахування змін функціонального стану клітин, дослідити зміну стану поверхневих рецепторів після дії інших чинників В основу винаходу поставлено завдання створити спосіб моделювання поверхневих рецепторів лімфоцитів шляхом удосконалення відомого способу, досягти можливості визначення змін функціонального стану лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов та на фоні дії різних чинників Поставлене завдання вирішують створенням способу моделювання поверхневих рецепторів лімфоцитів, що включає інкубування in vitro попередньо відмитих лімфоцитів з пептидним екстрак CO Ю 53122 том та оцінку його впливу на лімфоцити, який відревматологии Науч обзор / Под ред В А Насорізняється тим, що згідно винаходу, в якості пепновой — М , 1974] За відсутність флюоресценцм тидного екстракту використовують пептидний експриймали наявність власної флюоресценцм (дуже тракт паренхиматозного органу з широким слабке СВІТІННЯ) Зміну функціональної активності спектром біологічної активності, а вплив оцінюють клітин оцінювали шляхом визначення типів переза зміною характеру експресії поверхневих рецепгрупувань рецепторів у площині мембрани Низьторів з використанням моноклональних антитіл кий рівень функціональної активності визначається дифузним типом СВІТІННЯ, коли рецептори Спосіб, який заявляється, здійснюється слідурівномірно розподілені у площині мембрани Підючим чиним 3 периферійної крові донорів отривищення функціональної активності реєструється, мували суспензію лімфоцитів шляхом центрифуколи рецептори перерозподіляються, формуючи гування у градієнті густини фікол-триомбраст, з кепи (у вигляді "шапочки"), кластери (групи рецепнаступним відмиванням у фосфатно-сольовомуторів) та петчі (у вигляді плям) [Иммунология / Под буфері Лімфоцити у кінцевій концентрації 1 - 1,5 х 6 ред У Пола — М , 1987 — т 1] 10 /мл культивували у середовищі 199 ("Sigma") з 10% шактивованою телячою сироваткою ІнкубаВикористання запропонованого способу покацію клітин з пептидним комплексом нирок в дозі зало, що пептидний комплекс, отриманий з кірко0,05, 0,12 та 0,5мкг/мл протягом 60 хвилин при вої речовини нирок, впливає на рецепторний апа37°С проводили безпосередньо з інтактними лімрат переважно Т-клітин (CD3, CD4, CD8) та HLAфоцитами або після попередньої інкубації з фізюDr, що супроводжується дозозалежним підсиленлопчно-активними речовинами В якості контролю ням їх експресії та зміною функціонального стану використовували фосфатно-сольовий буфер ЕксСпостерігалось підвищення КІЛЬКОСТІ КЛІТИН З перепресію поверхневих рецепторів лімфоцитів оцінюгрупуванням рецепторів у вигляді кепів, петчів, вали за допомогою реакцій прямої та непрямої поява нових кластерів імунофлюоресценцм на мікроскопі "Люмам - Р8" за Враховуючи, що в організмі існує ціла сіть ензміною рівня та характеру флюоресценцм ВІДПОВІдогенних імуномодуляторів - лімфокшів, МОНОКІНІВ, ДНИХ антитіл Підраховували КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН, ЩО штерлейкінів, інтерферонів, які відіграють важливу СВІТЯТЬСЯ, на 200 клітин та визначали у відсотках роль при фізіологічних та патологічних реакціях, Для оцінки рівня експресії рахували загальну КІЛЬми дослідили, як діє пептидний комплекс нирок на КІСТЬ КЛІТИН, що світяться, та диференціювали стустан поверхневих рецепторів лімфоцитів на фоні пінь флюоресценцм, виділяючи такі групи перша синтерферону Попередня інкубація мононуклеагрупа - клітини, у яких відсутня флюоресценція (0 рних клітин з синтерфероном протягом 60 хвилини балів), друга група - слабкий ступінь флюоресценпри 37°С в кінцевій концентрації 100МО/мл прицм (1 бал), третя група - середній ступінь флюорезвела до зниження рівня експресії антигенних десценцм (2 бали), четверта група - сильний ступінь термінант CD3, CD4, CD8 та HLA-Dr (Табл ) флюоресценцм (3 бали) [Современные проблемы Таблиця Вплив пептидного комплексу нирок на експресію поверхневих рецепторів лімфоцитів на фоні дії аштерферона Досліджувані групи Експресія поверхневих антигенних детермінант лімфоцитів, % CD3 CD4 CD8 HLA-Dr CD 72 59,8 ± 2,48 44,4 ±1,52 46,8 ±1,44 26,2 ± 2,56 14,4 ±0,88 Інтактні клітини Клітини, шкубовані з а33,4 ±1,92* штерфероном Клітини, шкубовані з аштерфероном та пептидним 49,2 ±1,44** комплексом нирок 16,0 ±1,20* 37,6 ± 0,88* 21,4 ± 1,12 21,0 ±0,40* 32,8 ± 2,32** 44,4 ± 0,88* 29,0 ± 0,40* 26,0 ±1,20** Примітка * - р < 0,05 Під ВПЛИВОМ синтерферона практично зникали клітини з діфузним типом СВІТІННЯ, зменшилась КІЛЬКІСТЬ CD3+ клітин, які формують на мембрані кепи слабкого та середнього ступеня флюоресценцм, петчи всіх ступенів СВІТІННЯ У два рази порівняно з висхідним рівнем зменшилась КІЛЬКІСТЬ CD4+ клітин, які утворювали на мембрані кепи слабкого та середнього ступеня флюоресценцм, на 13% знизився рівень утворення петчів середнього ступеня СВІТІННЯ СХІДНІ ЗМІНИ спостерігались на CD8+ та HLA-Dr+ клітинах Для В-клітин (CD72+) підвищувався загальний рівень флюоресценцм, збільшувалась КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН З перегрупу ванням рецепторів у вигляді кепівта петчів середнього ступеня СВІТІННЯ Додавання до суспензії прешкубованих з аштерфероном лімфоцитів пептидного комплекса з кіркової речовини нирок призводило до підвищення експресії усіх досліджуваних рецепторів (Табл ) КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН, ЯКІ експресують HLA-Dr та CD72, не ТІЛЬКІ відновлювалась, але й збільшилась вище висхідного рівня Спостерігався перерозподіл інтенсивності СВІТІННЯ клітин в бік сильного ступеня КІЛЬКІСТЬ CD8+ - клітин, які характеризувались сильним ступенем флюоресценцм (3 бала), збільшилась у 2,9 рази, a HLA-Dr+ - у 2,2 рази Під впли 53122 вом пептидного комплексу збільшилась КІЛЬКІСТЬ CD3+ і HLA-Dr+ - клітин, які формують на мембрані петчи слабкого та середнього ступеня флюоресценцм Для CD8+ и CD22+ - клітин спостерігалось збільшення перегрупувань рецепторів у вигляді петчів та кепів середнього та сильного ступеня СВІТІННЯ, підвищилась КІЛЬКІСТЬ CD4+ - клітин з кластерами середнього ступеня СВІТІННЯ Таким чином, пептидний комплекс нирок виявляє антагонізм по відношенню до дії а штерферона на експресію мембранних маркерів Тклітин (CD3+, CD4+, CD8+) і синергізм - В-клітин (CD72+) Властивість відновлювати знижену під впливом синтерферона експресію досліджуваних рецепторів дозволяє припустити, що пептидний комплекс нирок реалізує свої ефекти моделювання рецепторів на мембранному рівні, сприяючи появі на мембрані заглиблених в и шар рецепторів, або впливаючи на процеси синтезу та транспорту на мембрану нових рецепторних молекул ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24