Спосіб одержання високоочищеного a2-антиплазміну з плазми крові людини

Спосіб виділення високоочищеного а 2 антиплазміну з плазми крові людини, що включає афінну хроматографію, який відрізняється тим, що а 2 -антиплазмін одержують з використанням послідовної хроматографії на лізин-, К 1-3 (І форма) та К 1 -З (І І форма)-сефарозі РІЗНІ способи виділення аг-антиплазміну базуються на його здатності з високою спорідненістю взаємодіяти з певними структурами в N-кшцевій частині молекули плазміногена, так званими лізинзв'язуючими ділянками Подібна здатність властива плазменним білкам фібриногену та пстидинбагатому білку Одержання препаратів аг-антиплазміну без домішок цих білків потребує додаткових трудомістких етапів очистки Особливо це стосується пстидинбагатого білка, який має дуже близьку до a-zантиплазміну молекулярну масу - 68кДа Гістидинбагатий білок знижує швидкість інгібування плазміну (Х2-антиплазмшом [4] і має однакову з a-zантиплазміном здатність пригнічувати зв'язування плазміногена з фібрином [5] Для виділення сі2-антиплазміну використовують комбінацію традиційних методів одержання білків, іонообмінну та афінну хроматографію [6] Процедура включає в себе афінну хроматографію на лізин-сефарозі, фракціонування плазми сульфатом амонію, хроматографію на ДЕАЕсефадексі, афінну хроматографію на плазміногенсефарозі та хроматографію на пдроксиапатиті Описаний спосіб має низький вихід інгібітору з невисокою питомою активністю Запропонований іншими авторами метод дозволяє отримати білок з більш високим ступенем очистки та високою питомою активністю На першому етапі з цитратної плазми видаляють плазміноген на лізин-сефарозі, потім проводять хроматографію на плазміноген-сефарозі, ДЕАЕ-сефадексі (О со Ю 53146 А-50, конканавалін А-сефарозі [7] Недоліком даної графії Це дозволяє в один етап одержати a-zпроцедури є її багатоетапність, що вимагає значантиплазмін з високою шпбіторною активністю без них витрат часу та праці домішок фібриногену та пстидинбагатого білка Встановлено, що взаємодія аг-антиплазміну з Паралельним завданням є більш повна утилізація плазміногеном опосередкована лізин-зв'язуючими донорської плазми ділянками останнього, що розташовані в перших Для вирішення задачі донорську плазму нанотрьох N-кшцевих кринглових доменах (К 1 - 3) [8] сять на три послідовно з'єднані афінноПлазма містить дві ізоформи плазміногена, що хроматографічні колонки перша з лізинрізняться за КІЛЬКІСТЮ вуглеводних компонентів сефарозою, друга з К1 - 3-сефарозою (Туг79Форма І гликозильована в положеннях Asn288 та Val353,1 форма), третя з К1 - 3-сефарозою (Туг79Thr345, форма II - тільки в положенні Thr345 a-zVal337, II форма) І та II форми кринглів розділяли Антиплазмін виявляє високу, спорідненість саме на конканавалін А-сефарозі [14] до II форми плазміногена [9] Отримані дані доНа лізин-сефарозі плазму виснажують на плазволили створити новий афінний сорбент, в якому зміноген, тим самим вивільняючи частку a-zвисоко специфічним лігандом для аг-антиплазміну антиплазміну, що в плазмі крові циркулює в комбув фрагмент II форми плазміногена К1 - 3 (Туг79 плексі з плазміногеном На К1 - З (І форма)Val337), іммобілізований на бромцианактивованійсефарозі плазму виснажують на фібриноген та сефарозі [10] К 1 - 3 одержували з еластазного пстидинбагатий білок На К1 - З (II форма)гідролізату II форми плазміногена (11) її II форми сефарозі специфічно сорбується аг-антиплазмін плазміногена розділяли на лізин-сефарозі за різної Після нанесення плазми колонки промивають концентрації 6-амшогексановоі кислоти [9] Запроробочим буфером з високою іонною силою для понований сорбент дозволяє підвищити вихід інгівидалення неспецифічно сорбованих білків Елюбітору [5] Цитратну плазму послідовно наносять цію сі2-антиплазміну з третьої колонки проводять на лізин-сефарозу, К1 - З (II форма)-сефарозу та робочим буфером, що містить 6-амшогексанову отримують матеріал, що містить близько 80% a-zкислоту антиплазміну та домішки фібриногену й пстидинОдержаний сі2-антиплазмін за даними електбагатого білка Фібриноген видаляють гельрофорезу має молекулярну масу 70кДа і є гомофільтрацією на Ultrogel АСА 44 Для отримання a-zгенним (без домішок фібриногену і пстидинбагатоантиплазміну без домішок пстидинбагатого білка го білка) Виділений аг-антиплазмін проявляє використовують додатковий етап очистки - іоновисоку шпбіторну активність, яку визначають за обмінну хроматографію на ДЕАЕ-сефадексі А-50 здатністю інгібувати гідроліз плазміном специфіч[12] Дана процедура також тривала й трудомістка ного хромогенного субстрату D-Val-L-Leu-L-Lys-nКрім того, етапи гель-фільтрацм, іонообмінної хронітроаниліду [15] Отримані препарати a-zматографії, що призводять до багаторазового розантиплазміну зберігають при - 40°С або люфілізубавлення а2-антиплазміну, і його наступне конценють трування негативно впливають на вихід та Можливість здійснення способу підтверджуактивність кінцевого препарату ється прикладами Як прототип обрано метод одержання a-zПриклад 1 антиплазміну, що складається з чотирьох етапів 200мл цитратної донорської плазми, до якої видалення плазміногена з цитратної донорської додавали детергент тритон Х-100 до 0,01% кінцеплазми на лізин-сефарозі, осадження спиртом вої концентрації, наносили зі швидкістю 15 фібриногена, одержання аг-антиплазміну афінною 20мл/год при + 4°С на три послідовно з'єднані хроматографією на К1 - 3-сефарозі та очистка афінно-хроматографічні колонки препарату на ДЕАЕ-сефадексі А-50 від домішок - лізин-сефарозу 4В, 50мл гелю сефарози, попстидинбагатого білка [13] Описаний спосіб допередньо зрівноваженою 0 05М натріи-фосфатним зволяє видалити етап гель-фільтрацм і таким чибуфером, рН 7,4, ном підвищити вихід та отримати а2-антишіазмш з - К1 - З (І форма)-сефарозу 4В, 20мл гелю севисокою шпбіторною активністю Однак, цей метод фарози, що містить 2мг К1 - 3 на 1мл гелю, попетакож вимагає значних витрат часу, праці і для редньо зрівноваженою 0.04М натріи-фосфатним видалення пстидинбагатого білка потребує додатбуфером, рН 7,0, кового етапу очистки з наступним концентруван- К1 - З (II форма)-сефарозу 4В, 20мл гелю ням після іонообмінної хроматографії сефарози, що містить 2мг К1 - 3 на 1мл гелю, поТаким чином, виділення аг-антиплазміну з допередньо зрівноваженою 0.04М натріи-фосфатним норської плазми - багатоетапний процес, пов'язабуфером, рН 7,0 ний зі значними витратами часу, праці, а отримаПісля нанесення плазми третю колонку проний білок містить домішки фібриногену та мивають 0.04М натріи-фосфатним буфером, рН пстидинбагатого білка, що потребує додаткових 7,0, що містить 0,5М хлорид натрію до 0 - 0,02 етапів очистки та концентрування, внаслідок чого значень екстинкції розчину при 280нм Специфічну значно зменшується вихід та активність інгібітору елюцію сі2-антиплазміну проводять 0.04М натрійЗадачею даного винаходу є розробка простого фосфатним буфером, рН 7,0, що містить 0.05М 6та швидкого способу виділення аг-антиплазміну з аміногексанову кислоту Збирають фракції об'ємом використанням послідовної афінної хроматографії 1,25мл Фракції, екстинкція яких становить 0,5 - 2,0 на лізин-, К1 - З (І форма) та К1 - З (II форма)при 280нм, об'єднують аг-Антиплазмін діалізують сефарозі без застосування додаткових методів проти охолодженої дистильованої води, в яку доочистки - гель-фільтрацм та іонообмінної хроматодають бікарбонат амонію до слабо лужної реакції 53146 Концентрацію інгібітору визначають, вимірюючи оптичне поглинання за 280нм і віднімаючи значення поглинання за 320нм Концентрацію розраховують за значенням коефіцієнта екстинкції ( 1 % , 1см) а2-антиплазміну, що дорівнює 6,7 Активність сі2-антиплазміну визначають за інгібуванням амідолітичної активності плазміну з відомим відсотком активних центрів Молярне співвідношення a-zантиплазміну до плазміну дорівнює 1 1 Активність одержаних препаратів перевищує 90% Приклад 2 Виділення сі2-антиплазміну проводять, як показано в прикладі 1, але донорську плазму розбавляють ВДВІЧІ для зменшення в'язкості Розбавлення плазми збільшує тривалість виділення a-zантиплазміну, внаслідок чого його шпбіторна активність дещо знижується Приклад З сі2-антиплазмін виділяють, як описано у прикладі 1, але в плазму не додають тритон Х-100 Відсутність детергенту не впливає на концентрацію та активність отриманого шпбітора, але не дозволяє використовувати плазму з високим вмістом ЛІПІДІВ Таким чином, запропоновано простий та швидкий спосіб виділення високоочищеного інгібітору плазміну з плазми крові людини Спосіб дозволяє в один етап без застосування додаткових методів очистки - гель-фільтрацм та іонообмінної хроматографії одержати сі2-антиплазмін без домішок фібриногену та пстидинбагатого білка з високою шпбіторною активністю Список посилань 1 Dano К, Andersen P A , Grondahl-Hansen J , Knstensen P, Neilsen L S , Sknver L Plasmmogen activator, tissue degradation and cancer Adv Cancer Res - 1 9 8 5 - 44, №1 - p 139 - 2 2 6 2 Chapman H A Plasmmogen activator, integrms, and the coordinated regulation of cell adhesion and migration Curr Opm Cell Biol - 1997 - 9, - p 714 724 3 Lottenberg R A novel approach to explore the role of plasmmogen in bacterial pathogenesis Trends Microbiol - 1 9 9 7 - 5 - p 466 - 468 4 Lijnen H R, Rylatt D В, Collen D Physicochemical, immunochemical and functional comparison of human histidme-nch glycoprotem and autorosette inhibitor factor Biochim Biophys Acta 1983 - 7 4 2 , №1 - p 1 0 9 - 1 1 5 5 Lijnen H R , Hoylaerts M , Collen D Isolation and characterization of a human plasma protein with affinity for thelysme binding sites in plasmmogen J B C - 1 9 8 0 -255, №21 - p 1 0 2 1 4 - 1 0 2 2 2 6 Moroi M , Aoki N Isolation and characterization of a/z-plasmm inhibitor from human plasma A novel protemase inhibitor which inhibits activator-induced clot lysis J Biol Chem - 1 9 7 6 - 2 5 1 , №19 - p 5956 -5965 7 Wiman В, Collen D Purification and characterization of human antiplasmm, the fast-acting plasmm inhibitor in plasma Eur J Biochem - 1 9 7 7 78, №1 - p 1 9 - 2 6 8 Wiman В , Lijnen H R , Collen D On the specific interaction between the lysme-bmding sites in plasmm and complementary sites in a2-antiplasmm and in fibnnogen Biochim Biophys Acta - 1 9 7 9 - 579, №1 -p 142-154 9 Hayes M L , Castellmo F J Carbohydrate of the human plasmmogen variants J Biol Chem - 1 9 7 9 254, № - p 8768 - 8771 10 March S С , Pankh I , Cuatrecasas P A simplified method for cyanogens bromide activation of agarose for affinity chromatography Anal Biochem - 1974 60, №1 - p 1 4 9 - 1 5 2 11 Sottrup-Jensen L , Zaidel M , Claeys H et al The primary structure of human plasmmogen isolation of two lysme-binding fragments and one "mimplasmmogen" (M W 38000) by elastase catalyzed specific limited proteolysis Progress in chemical fibrmolysis and thrombolysis N Y Raven Press 1978 - 3 - p 191 - 2 0 9 12 Wiman В Affmity-chromatographic purification of human a 2 -antiplasmm Biochem J - 1 9 8 0 - 1 9 1 , № 1 - p 229 - 232 13 Lijnen H R , Collen D Alpha-2-antiplasmm J Med - 1 9 8 5 - 1 6 , № 1 - 3 - p 225 - 283 14 Anas M , Sous D , Diaz-Maurmo T Involvement of the lysme-binding site of plasmmogen on its interaction with concanavalm A Thromb Res - 1 9 8 9 - 5 6 , №6 - p 7 0 9 - 7 1 8 15 Wiman В Human a2-antiplasmm Methods in Enzynol -1981 - 8 0 - p 395 - 408 TOB "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24