Спосіб одержання пробіотику з аерококів

1 Спосіб одержання пробютику з аерококів, що включає вирощування виробничого штаму культури аерококів на живильному середовищі у пробірках з м'ясо-пептоновим агаром при температурі 36±1°С, бактерюскопічний та бактеріологічний контроль чистоти культури, розлив препарату у ємності, наступну люфілізацію у вакуумсушильних апаратах і герметизацію, який відрізняється тим, що вирощування проводять в декі лька етапів, причому на першому етапі вирощують першу генерацію штаму культури аерококів, переважно Aerococcus vindans 167, протягом 1 8 - 4 8 годин, на другому етапі вирощують наступну маткову генерацію протягом 1 8 - 4 8 годин, на третьому етапі маткову культуру засівають в матраци з казеїновим агаром, який містить 10мг/мл глюкози, 20 - 50мкг/мл грамурину, 1 - 5мкг/мл етонію, і протягом 1 8 - 4 8 годин вирощують виробничу культуру, а по закінченні строку інкубації здійснюють змив мікробної маси в асептичних умовах додаванням водного розчину стабілізатора 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що в усіх живильних середовищах перед засівом культур аерококів рН доводять до значення 6,8 - 8,0 Винахід відноситься до мікробіологи, а саме, до способу одержання лікувально-профілактичних бактеріальних препаратів з аерококів Відомий спосіб одержання біопрепарату для лікування і профілактики захворювань слизових оболонок і шкірних покривів (1), що полягає у вирощуванні культури аерококів на живильному середовищі при наступних умовах Оптимум температурного росту (36 ± 1)°С На м'ясо-пептоновому бульйоні штам зростає, утворюючи поверхневу зону Оптимальний ріст аерококів спостерігається через 24 години при (36 ± 1)°С на м'ясо-пептоновому агарі Склад середовища для культивування штаму такий Агар мікробіологічний ГОСТ 1 7206-84 22мл Глюкоза ГОСТ 603 8-79 40г Пептон сухий ферментативний для бактеріологічного призначення ГОСТ 13805-76 10г Вода дистильована ГОСТ 6709-72 1л Для приготування середовища дистильовану воду змішують з пептоном та агаром Суміш витримують 20 - ЗО хвилин при кімнатній температурі для набухання агару, і кип'ятять 1 5 - 2 0 хвилин до його повного розплавлення Далі 30%-розчином оцтової кислоти встановлюють рН 3,8 Після го динного відстоювання середовище декантують через ватно-марлевий фільтр і додають глюкозу, після чого стерилізують при температурі (110 ± 1)°С на протязі ЗО хвилин На живильному середовищі виростають колони діаметром 0,5 - 2,0мм у вигляді плоских безбарвних дисків По закінченні строку інкубації здійснюють змив мікробної маси у асептичних умовах шляхом додавання водного розчину стабілізатора Мікробну суспензію збирають у бутель і проводять бактерюскопічний та бактеріологічний контроль чистоти культури Препарат розливають по 1 або 2 дози в ампули типа ШП-5-НС-1 або ШП-5-НС-3 по Ост 64-2485-85 або по 25 - ЗО доз у пляшки (ОСТ 10782-85) ємністю 250мл, люфілізують у вакуум-сушильних апаратах і герметизують Одна доза (1мл) містить не менш 2 - Ю 4 життєздатних аерококів Основним недоліком прототипу є мала концентрація клітин аерококів у процесі культивування за рахунок вирощування біомаси аерококів на пептоново-глюкозному агарі, який має низьке значення Рн = 3,8 живильного середовища В основу винаходу поставлено задачу створити спосіб одержання пробютику з аерококів з підвищеним виходом клітин аерококів Задача винаходу вирішується тим, що у відо О со го ю 53301 мому способі одержання пробютику з аерококів, що включає вирощування виробничого штаму культури аерококів на живильному середовищі у пробірках з м'ясо-пептоновим агаром при температурі 36 ± 1°С, бактерюскопічний та бактеріологічний контроль чистоти культури, розлив препарату у ємності, наступну люфілізацію у вакуум - сушильних апаратах і герметизацію, згідно винаходу, вирощування проводять в декілька етапів, причому на першому етапі вирощують першу генерацію штаму культури аерококів, переважно, Aerococcus vindans 167, на протязі 1 8 - 4 8 годин, на другому етапі вирощують наступну маткову генерацію на протязі 1 8 - 4 8 годин, на третьому етапі маткова культуру засівають в матраци з казеїновим агаром, який містить 10мг/мл глюкози, 20 - 50мкг/мл грамуршу, 1 - 5мкг/мл етонію, і на протязі 1 8 - 4 8 годин вирощують виробничу культуру, а по закінченні строку інкубації здійснюють змив мікробної маси в асептичних умовах додаванням водного розчину стабілізатора Дослідницьким шляхом було встановлено, що найбільший вихід клітин культур аерококів відбувається тоді, коли в усіх живильних середовищах перед засівом культур аерококів значення рН становить 6,8 - 8,0 Винахід пояснюється схемою /див фіг/, на якої зображено етапи одержання пробютику з аерококів На перших 2-х етапах одержується маткова культура На першому етапі вирощується перша генерація Aerococcus vindans 167 в пробірках з м'ясопептоновим агаром при (36 ± 1)°С на протязі 18 48 годин На другому етапі з неї вирощується маткова генерація штаму культури аерококів, переважно, Aerococcus vindans 167, в пробірках з м'ясопептоновим агаром при (36 ± 1)°С на протязі 18 48 годин На третьому етапі маткова культура засівається в матраци з казеїновим агаром, який містить 10мг/мл глюкози, 20 - 50мкг/мл грамуршу, 1 5мкг/мл етонію, і вирощується при (36 ± 1)°С на протязі 18-48 годин По закінченні строку інкубації здійснюють змив мікробної маси в асептичних умовах шляхом додавання водного розчину стабілізатора Мікробну суспензію збирають у бутель і проводять бактерюскопічний та бактеріологічний контроль чистоти культури Препарат розливають по 1 або 2 дози в ампули типа ШП-5-НС-1 або ШП-5-НС-3 по Ост 64-2485-85 або по 25 - ЗО доз у пляшки (ОСТ 10782-85) ємністю 250мл, люфілізують у вакуум-сушильних апаратах і герметизують Одна доза (1мл) містить не менш 2 - Ю 8 життєздатних аерококів Абактерш являє собою висушені ліофільно живі вегетативні клітини бактерій, стабілізатор - желатин і сахарозу, сухі компоненти живильного середовища і біологічно активні речовини, що продукуються штамом, - антиоксидантні ферменти, амінокислоти, лізоцим, антибіотики, екзополісахариди, лектатооксидазу Препарат розчинюється протягом двох хвилин при періодичному потрушуванні пляшки або ампули після додавання розчинника (кип'ячена або дистильована вода, 0,9%-розчин хлориду натрію) із розрахунку 1 мл розчинника на одну ампулу препарату, 5мл розчинника на одну пляшку ємністю 10мл, 50мл розчинника на одну пляшку ємністю 50мл При розчиненні утворюється непрозора гомогенна суспензія, після чого визначається концентрація клітин у 1мл суспензії В найкращому варіанті здійснення в усіх живильних середовищах перед засівом культур штамів рН доводять до 6,8 - 8,0 Приклад 1 На першому етапі вирощували першу генерацію Aerococcus vindans 167 в пробірках з м'ясопептоновим агаром при температурі 36 ± 1°С на протязі 18 годин На другому етапі вирощували маткову генерацію Aerococcus vindans 167 в пробірках з м'ясопептоновим агаром при температурі 36 ± 1°С на протязі ЗО годин На третьому етапі маткову культуру 2-і генерації Aerococcus vindans 167 засівали в матраци з казеїновим агаром, який містив 10мг/мл глюкози, 20 - 50мкг/мл грамуршу, 1 - 5мкг/мл етонію, і вирощували при температурі 36 ± 1°С на протязі ЗО годин Значення рН в усіх середовищах перед засівом Aerococcus vindans 167 доводили до 6,8 По закінченні строку інкубації змивали мікробну масу в асептичних умовах шляхом додавання водного розчину стабілізатора Мікробну суспензію збирали у бутель і проводили бактерюскопічний та бактеріологічний контроль чистоти культури Препарат розливали по 1 або 2 дози в ампули типа ШП-5-НС-1, люфілізували у вакуум - сушильних апаратах і герметизували Приклад 2 На першому етапі вирощували першу генерацію Aerococcus vindans 167 в пробірках з м'ясопептоновим агаром при (36 ± 1)°С на протязі 24 годин На другому етапі вирощували маткову генерацію Aerococcus vindans 167 в пробірках з м'ясопептоновим агаром при (36 ± 1)°С на протязі 24 годин На третьому етапі маткову культуру 2-і генерації Aerococcus vindans 167 засівали в матраци з казеїновим агаром, який містив 10мг/мл глюкози, 20 - 50мкг/мл грамуршу, 1 - 5мкг/мл етонію і вирощували при (36 ± 1)°С на протязі 24 годин Значення рН в усіх середовищах перед засівом Aerococcus vindans 167 становило 7,4 По закінченні строку інкубації здійснювали змив мікробної маси в асептичних умовах шляхом додавання водного розчину стабілізатора Мікробну суспензію збирали у бутель і проводили бактерюскопічний та бактеріологічний контроль чистоти культури Препарат розливали по 5 - ЗО доз у пляшки (ОСТ 10782-85) ємністю 10 - 250мл, люфілізували у вакуум-сушильних апаратах і герметизували Приклад З На першому етапі вирощували першу генерацію Aerococcus vindans 167 в пробірках з м'ясопептоновим агаром при (36 ± 1)°С на протязі 48 годин На другому етапі вирощували маткову генерацію Aerococcus vindans 167 в пробірках з м'ясо 53301 пептоновим агаром при (36 ± 1)°С на протязі 48 парату, 5мл розчинника на одну пляшку ємністю годин 10мл, 50мл розчинника на одну пляшку ємністю 50мл При розчиненні утворюється непрозора гоНа третьому етапі маткову культуру 2-і генемогенна суспензія, після чого визначається концерації Aerococcus viridans 167 засівали в матраци з нтрація клітин в 1мл суспензії казеїновим агаром, який містив 10мг/мл глюкози, 20 - 50мкг/мл грамуршу, 1 - 5мкг/мл етонію, і виУ таблиці наведено дані о накопиченні клітин рощували при (36 ± 1)°С на протязі 48 годин Aerococcus viridans 167 при різних значеннях рН живильних середовищ в 1 мл суспензії АЗначення рН в усіх середовищах перед засібактерину вом Aerococcus viridans 167 становило 8,0 По закінченні строку інкубації здійснювали змив мікробної маси в асептичних умовах шляхом додавання Таблиця водного розчину стабілізатора Мікробну суспензію збирали у бутель і проводили бактерюскопічний та Накопичення клітин Aerococcus viridans 167 при бактеріологічний контроль чистоти культури різних значеннях рН середовища в 1 мл суспензії Препарат розливали по 1 або 2 дози в ампули А-бактерину ШП-5-НС-3 по Ост 64-2-485-85, люфілізували у вакуум-сушильних апаратах і герметизували КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН Aerococcus viridans Кожна доза (1 мл) отриманого препарату 167 на 1 мл суспензії А-бактерину /незалежно від прикладу здійснення/ містить не Назва штаму при різних значеннях рН середоменш 2 - Ю 8 життєздатних аерококів А-бактерш вища являє собою висушені ліофільно живі вегетативні 3,8 6,8 7,4 8,0 клітини бактерій, стабілізатор - желатин і сахарозу, Aerococcus 4 8 8 2 10 2 10 3,2 10 2,2 108 сухі компоненти живильного середовища і біологіviridans 167 чно активні речовини, що продукуються штамом, антиоксидантні ферменти, амінокислоти, лізоцим, Джерела інформації антибіотики, екзополісахариди, лектатооксидазу 1 Біопрепарат для лікування і профілактики заПрепарат розчинюється протягом двох хвилин хворювань слизових оболонок і шкірних покривів при періодичному потрушуванні пляшки або ампу№98126882 від 15 12 2000р Надруковано "Проли після додавання розчинника (кип'ячена або мислова власність Офіційний бюлетень" №7, дистильована вода, 0,9%-розчин хлориду натрію) 2000р із розрахунку 1 мл розчинника на одну ампулу преМЛА {рН 6,8-8,0) у пробірках лзофілізований промисловий штам Aerococcus vindans І 67 (Зб±І)°С,24-48г. 1-ї генерації МПА (рН 6,8-8,0} у пробірка* Н-і генерації вирощування Агар казеїновий (рИ 6,8-8,0} матраш (36±1)°С,24.48г Зросла мікробна маса на казеїновому агарі сахарозо-желатинове середовище ФІг. ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24