Спосіб виявлення алкалоїдів чемериці білої в рослинній сировині та біологічному матеріалі

Спосіб виявлення алкалоїдів чемериці білої в рослинній сировині та біологічному матеріалі, що 3 біологічному матеріалі шляхом екстрагування алкалоїдів із досліджуваного матеріалу, очищення фільтруванням, реекстрагування неполярним органічним розчинником та хроматографії, при цьому екстрагування алкалоїдів проводять хлороформом, а хроматографування виконують методом тонкошарової хроматографії на ТШХ пластинках із закріпленим шаром силікагелю у системі рухливого розчинника: хлороформ - метанол - 25% розчин аміаку у співвідношенні 90:8:2, що дає змогу забезпечити чистоту одержання алкалоїдів та зменшити затрати на реактиви. Спосіб визначення алкалоїдів чемериці білої, екстрагування алкалоїдів, очищення фільтруванням, перерозподіл екстрагентів у неполярний органічний розчинник, визначення методом тонкошарової хроматографії у прототипі є спільними ознаками зі способом, що заявляється. Для здійснення запропонованого способу екстрагування алкалоїдів чемериці білої із рослинної сировини та біологічного матеріалу проводять хлороформом, час екстрагування 2год, очищення фільтруванням і реекстрагуванням, а хроматографування виконують методом тонкошарової хроматографії на ТШХ пластинках із закріпленим шаром силікагелю у системі рухливого розчинника: хлороформ - метанол – 25 % розчин аміаку у співвідношенні 90:8:2. Алкалоїди виявляють реактивом Драгендорфа модифікованим за Муньє та кислотою хлористоводневою концентрованою з наступним підігрівом ТШХ пластинки. Порівняльний аналіз з прототипом дає змогу зробити висновок, що рішення, яке пропонується відповідає критерію «новизна». Спосіб здійснюють у такій послідовності. Реактиви готують у відповідності до вимог Державної Фармакопеї України (ДФУ: 1-е вид. / [Державне підприємство «Науково-експертний фармакопейний центр»]. - X.: Державне підприємство «Науково-експертний фармакопейний центр», 2001. - С.169-290). Проводять відбір проб для дослідження. Потім проводять екстракцію та первинну очистку витягів. Розчин порівняння: хлороформний розчин вератридину (концентрація 600мкг/мл) або хлороформні розчини стандартних зразків алкалоїдів. Хроматографування виконують на ТШХ пластинках «Sorbfil» F254 (із розміром частинок 5мкм до 40мкм) у системі рухливого розчинника: хлороформ - метанол - 25% розчин аміаку у співвідношенні 90:8:2, відповідно до вимог ДФУ (ДФУ: 1-е вид. - Доповнення 1 / [Державне підприємство «Науково-експертний фармакопейний центр»]. X.: Державне підприємство «Науково-експертний фармакопейний центр», 2001. - С.41-44). Виявлення: реактив Драгендорфа модифікований за Муньє, який готують безпосередньо перед використанням. Для цього 5мл розчину калію йодовісмутату змішують з 5мл 1% водного розчину кислоти аскорбінової і 5мл 95% спирту. Камеру насичену парами кислоти хлористоводневої концентрованої готують після закінчення хроматографування. Для цього 40мл кислоти хло 53659 4 ристоводневої концентрованої вносять в камеру і залишають на 15хв. Приклад 1 Рослинна сировина. Ектрагування алкалоїдів проводять у вигляді основ. Для цього подрібнену до 7мм рослинну сировину (4,0г) помішують в колбу з пришліфованим корком ємкістю 250мл, змочують 10мл 25% розчину аміаку і залишають на 5хв. Потім, додавши 120мл хлороформу, збовтують на вібраційному пристрої 2год. Хлороформну витяжку відфільтровують через вату, відкинувши перші 10мл фільтрату, і випаровують до 1/10 об'єму. До фільтрату додають 10% розчин хлористоводневої кислоти до рН=2,0-3,0 (за універсальним лакмусовим індикаторним папером) та переносять в ділильну лійку. Тричі екстрагують хлороформ порціями по 10мл, збовтуючи по 3-5хв кожну, витяжки фільтрують через паперовий фільтр з натрію сульфатом безводним, попередньо змоченим хлороформом. Ці фракції відкидають. До водного залишку додають 25% розчин аміаку до рН=8,0-9,0 (за універсальним лакмусовим індикаторним папером) і тричі збовтують з порціями хлороформу по 10мл протягом 5хв. Хлороформні витяжки фільтрують через паперовий фільтр з натрію сульфатом безводним, попередньо змочений хлороформом, в конічну колбу ємністю 100мл. Фільтр промивають 10мл хлороформу. Лужні хлороформні витяжки об'єднують, випарюють до 2мл і використовують для хроматографування. Приклад 2 Біологічний матеріал. До 10,0г подрібненого біологічного матеріалу (печінка, вміст рубця або шлунка) додають 30,0г натрію сульфату безводного, змішують та періодично перемішують у ступці до утворення сипкої маси (близько 2-3 годин). У вузьку нижню частину скляної колонки діаметром 17-20мм поміщають марлевий тампон, заливають хлороформ (частина від попередньо відміряного хлороформу об'ємом 100мл) та засипають отриману сипку масу, періодично додаючи хлороформ таким чином, щоб над біологічним матеріалом постійно утримувалося «дзеркало» товщиною 12см, після повного перенесення сипкої маси колонку залишають на годину. Далі над колонкою поміщають ділильну лійку з залишком хлороформу, який пропускають через колонку із швидкістю 6080 крапель за хвилину, утримуючи «дзеркало» над біологічним матеріалом. Хлороформний витяг збирають до колби і випаровують до 1/10 об'єму. З метою екстракційної очистки отриманого витягу тричі реекстрагують 0,1М розчином кислоти хлористоводневої порціями по 10мл. Хлороформні екстракти відокремлюють і відкидають. Водні витяги об'єднують, підлужнюють 25% розчином амоніаку до рН=8,0-9,0 і тричі екстрагують хлороформом порціями по 10мл (при утворенні стійких емульсій застосовують центрифугування (протягом 5хв. при 5000об./хв.)). Хлороформні витяги збирають до колби через паперовий фільтр («червона стрічка») з 1г натрію сульфату безводного, випарюють до 2 мл і використовують для хроматографування. Приклад 3 Хроматографування. Виявлення алкалоїдів чемериці білої проводять на ТШХ пластинках 5 53659 «Sorbfil» F254 (15×15см, із розміром частинок 5мкм до 40мкм) висхідним методом у системі рухливого розчинника: хлороформ - метанол - 25% розчин аміаку (90:8:2); в присутності «свідка» - хлороформного розчину вератридину (концентрація 600мкг/мл) або хлороформних розчинів стандартних зразків алкалоїдів. З метою очистки від супутніх речовин ТШХ пластинки, з нанесеними на лінію старту по 0,01мл дослідними пробами з діаметром плями не більше 0,5см, елююють в хлороформі. За цих умов алкалоїди чемериці білої залишаються на лінії старту, а супутні речовини мігрують до лінії фінішу. Хроматографування проводять в камері об'ємом 500см3, в яку вносять 50мл системи розчинників, приготовлену за 1-2год до аналізу. Камеру насичують 30хв, довжина шляху пробігу розчинника становить 10см. Дослідження проводять на двох ТШХ пластинках одночасно, які після закінчення Хроматографування висушують при 105110°С протягом 5хв до повного видалення розчинника. Виявлення А: ТШХ пластинку переглядають в УФ-світлі (плями із яскраво жовтою флуорисценцією), а потім обприскують реактивом Драгендорфа модифікованим за Муньє і переглядають при денному світлі. Результати: нижче наведено послідовність зон на хроматограмах випробовуваного розчину та розчину порівняння. На хроматограмі випробовуваного розчину можуть виявлятися також інші зони. Верхня частина пластинки малиново-червона зона вератридин, малиново-червона зона малиново-червона зона малиново-червона зона Розчин порівняння Випробовуваний розчин Комп’ютерна верстка А. Рябко 6 Виявлення В: ТШХ пластинку вносять на 10хв в камеру, насичену парами кислоти хлористоводневої концентрованої, і проявляють в УФ-світлі (плями фіолетового кольору), а за тим нагрівають до 60°С і переглядають при денному світлі. Результати: нижче наведено послідовність зон на хроматограмах випробовуваного розчину та розчину порівняння. На хроматограмі випробовуваного розчину можуть виявлятися також інші зони. Верхня частина пластинки оранжева зона вератридин, оранжева зона оранжева зона оранжева зона оранжева зона Розчин порівняння Випробовуваний розчин Однакове розміщення плям випробовуваного розчину та розчину порівняння дає можливість зробити висновок про наявність суми алкалоїдів чемериці білої в рослинній сировині та біологічному матеріалі, що дозволяє встановити діагноз і причину отруєння. Для документування проведених досліджень роблять фотокопію або відбиток хроматограми на кальку, які прикріплюють до акту експертизи хімікотоксикологічного дослідження. Спосіб виявлення алкалоїдів чемериці білої в рослинній сировині та біологічному матеріалі методом тонкошарової хроматографії, що пропонується, є ефективним. Його використання спрощує процедуру аналізу, підвищує точність визначення і є економічно вигідним. Таким чином, запропонований спосіб виявлення алкалоїдів чемериці білої в рослинній сировині та біологічному матеріалі може знайти застосування у фармацевтичному та судовотоксикологічному аналізі. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601