Набір для виявлення специфічних антитіл до параміксовірусів і, іі, ііі серотипів в реакції гальмування гемаглютинації

Набір для виявлення специфічних антитіл до параміксовірусів І, II, III серотипів в реакції затримки гемаглютинації, який характеризується тим, що містить штами : параміксовірус І серотипу - LaSota, параміксовірус II серотипу - APMV-2/chicken/ California/Yucaipa/56, параміксовірус III серотипу APMV-3/turkey/Wisconsin/68, та специфічні сироватки до цих штамів і додатково містить набір солей для приготування розчинів. (19) (21) u201000521 (22) 20.01.2010 (24) 25.10.2010 (46) 25.10.2010, Бюл.№ 20, 2010 р. (72) АСАНОВА МАРІЯ РУСТАМІВНА, ГОЛОВКО АНАТОЛІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, УШКАЛОВ ВАЛЕРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, БАБКІН МИХАЙЛО ВАЛЕРІЙОВИЧ (73) ДЕРЖАВНИЙ НАУКОВО-КОНТРОЛЬНИЙ ІНСТИТУТ БІОТЕХНОЛОГІЇ ТА ШТАМІВ МІКРООРГАНІЗМІВ 3 - антиген І серотипу інактивований, ліофілізований; - антиген II серотипу інактивований, ліофілізований; - антиген III серотипу інактивований, ліофілізований; - сироватки крові курей до І, II та III серотипів гіперімунна (позитивний контроль), ліофілізована; - сироватка крові курей нормальна (негативний контроль), ліофілізована. Неспецифічні компоненти: - набір солей для приготування буферного розчину, порошок; - сіль натрію лимоннокислого, порошок; - 96-луночні кругло донні полістиролові мікропанелі для мікробіологічних реакцій. Приклад 1 1. Приготування робочих розчинів Розчин №1. Для приготування розчину №1 вміст флакону з набором солей для приготування забуференого фізіологічного розчину розчинити у 2000 см3 дистильованої води. Розчин зберігати при температурі 2-8°С не більше 1 місяця. Розчин №2. Для приготування розчину №2 вміст флакону з сіллю натрію лимоннокислого розчинити в 100 см3 розчину №1. Розчин зберігати при температурі 2-8°С не більше 1 місяця. 2. Підготовка імуноспецифічних компонентів набору 2.1 Вміст флаконів з антигенами І, II ті III серотипів розчинити в 2,0 см3 розчину №1. Підготовлений антиген зберігати за температури 2-8°С не більше 1 місяця. 2.2 Вміст флаконів з позитивною сироваткою І, II ті III серотипів розчинити в 0,5 см3 розчину №1. Підготовлену позитивну сироватку рекомендується зберігати за температури не вище мінус 10°С не більше 1 місяця. Під час зберігання допускається розморожування до 2-3 разів. Сироватка в рідкому вигляді готова до використання. Відкритий флакон рекомендується зберігати за температури не вище мінус 10°С не більше 1 місяця. Під час зберігання допускається розморожування до 2-3 разів. 2.3 Вміст флакону з негативною сироваткою розчинити в 0,5 см3 розчину №1. Підготовлену негативну сироватку рекомендується зберігати за температури не вище мінус 10°С не більше 1 місяця. Під час зберігання допускається розморожування до 2-3 разів. Сироватка в рідкому вигляді готова до використання. Відкритий флакон рекомендується зберігати за температури не вище мінус 10°С не більше 1 місяця. Під час зберігання допускається розморожування до 2-3 разів. 2.4 Для отримання еритроцитів використовують курчат, курей або півнів-донорів, що не мають антитіл до параміксовірусів І, II та III серотипів. Кров беруть з підкрильцевої вени або шляхом скарифікації гребня у флакони з розчином №2 у співвідношенні 1:2, триразово відмивають розчином №1 шляхом центрифугування при 1500 об/хв. 53802 4 10 хвилин. З осаду еритроцитів на розчині №1 готують 1% суспензію. Для цього в 99 см3 розчину №1 додають 1 см3 концентрату еритроцитів (осад). Зберігати суспензію за температури 2-8°С до появи ознак гемолізу. Реакцію гальмування гемаглютинації проводять в три етапи: - визначення гемаглютинуючих титрів антигенів І, II та III серотипів в реакції гемаглютинації (РГА); - підготовка робочої дози антигену; - виявлення специфічних антитіл І та II серотипу в пробах сироватки крові. 4.1 Постановка реакції гемаглютинації (РГА) Для постановки РГА готують двократне розведення антигену від 1:2 до 1:4096. з цією метою в усі лунки полістиролової панелі вносять піпеткою розчин №1 (0,05 або 0,025 см3). В першу лунку горизонтального ряду додати рівний об'єм підготовленого антигену №1, триразове пропіпетувати та перенести по 0,05 або 0,025 см3 в другу лунку і т.д. з останньої лунки видаляють по 0,05 або 0,025 см3 матеріалу в 2%-й розчин їдкого натру або інший подібний дезінфектант. Після розведення антигену в усі лунки вносять 1% завись еритроцитів в об'ємі, що дорівнює початковому об'єму розчину №1, мікропанелі обережно струшують та залишають при кімнатній температурі 20-25°С на 40-60 хвилин. Постановку РГА з антигенами II та III серотипів проводять аналогічно. Для контролю еритроцитів на відсутність спонтанної аглютинації та визначення часу обліку реакції в дві-три лунки мікропанелі з двійним об'ємом розчину №1 (1,0 або 0,05 см3) додати по 0,05 або 0,025 см3 суспензії еритроцитів. Облік реакції проводять після осідання еритроцитів у вигляді "ґудзика" в контрольних лунках. Оцінка результатів РГА з антигенами №I, №II та №III відбувається однаково. РГА оцінюють позитивно при осіданні еритроцитів у вигляді добре вираженої "парасольки", негативно - у вигляді "ґудзика", за умови спонтанної аглютинації в контролі. Примітка. Отримання нечітких результатів може бути пов'язано зі зміною рН розчину №2 або індивідуальними особливостями еритроцитів птахів-донорів. 4.2 Підготовка робочої дози антигену Для постановки РГГА готують робочу дозу антигену (4ГАЕ), виходячи з його титру, що був встановлений в РГА. Робочу дозу визначають окремо для кожного антигену. Для цього антиген і по черзі розводять розчином №1 в стільки разів, скільки отримують від ділення його титру на 4. Наприклад: титр антигену в РГА 1:256. Таким чином, для приготування робочого розведення антигену необхідно взяти 63,0 см3 розчину №1 та 1,0 см3 антигену (256:4=64). Об'єм робочої дози антигену визначають виходячи з кількості проб сироваток, що потрібно дослідити. Для постановки РГГА мікрометодом на дослідження 1 сироватки у 12 розведеннях потрібно 0,6 см3 або 0,3 см3 4ГАЕ антигену (в залежності від 5 53802 первинного об'єму буферного фізіологічного розчину). 4.3 Робочу дозу антигену готують безпосередньо в день постановки реакції з обов'язковим контролем 4ГАЕ. Для цього в 4 лунки розливають розчин №1 в об'ємі який вибрано для постановки реакції. В першу лунку додають рівний об'єм робочої дози антигену і титрують згідно з п.4.1. Для визначення часу обліку реакції в дві-три лунки мікропанелі з двійним об'ємом розчину №1 (0,1 см3 або 0,05 см3) додають по 0,05 см3 або 0,025 см3 1% суспензії еритроцитів відповідно. 4.4 Облік реакції Облік реакції проводять після осідання еритроцитів в контролі. При вірному визначенні робочої дози антигену в першій та другій лунках повинна бути аглютинації ("парасолька"), в третій лунцічасткова, в четвертій-відсутність аглютинації ("ґудзик"). Повна аглютинація в третій лунці свідчить про завищену дозу антигену, а відсутність аглютинації в першій або другій лунках свідчить про його недостатню кількість. Коректують робочу дозу антигену шляхом додавання антигену або розчину №1 з обов'язковим повторним контролем 4ГАЕ. 4.5 Визначення специфічних антитіл в пробах сироватки крові в РГГА. 4.5.1 В усі лунки полістиролового планшета внести розчин №1 в об'ємі 0,05 см3 або 0,025 см3, потім в першу лунку горизонтального ряду додати рівний об'єм досліджуваної сироватки, що підготовлена по п.3, пропіпетувати три рази та приготувати ряд послідовних двократних розведень (з 1:2 до 1:4096). Після цього, в усі лунки внести робоче розведення антигену №1 в об'ємі 0,05 см3 або 0,025 см3, обережно струсити і після 30 хвилин контакту за температури 20-25°С в кожну лунку додати 0,05 см3 або 0,025 см3 1% суспензії еритроцитів. Мікропанелі обережно струсити та залишити за температури 20-25°С на 40-60 хвилин. 4.5.2 Одночасно ставлять контролі реакції. - на відсутність ізоаглютинації сироваток - в одну лунку мікропанелі внести 0,05 см3 або 0,025 см3 розчину №1, додати рівний об'єм дослі Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 6 джуваної сироватки та 1% суспензію еритроцитів. Аглютинація еритроцитів повинна бути відсутньою. В разі ізоаглютинації до 0,05 см3 сироватки додати 0,025 см3 осаду відмитих еритроцитів, струсити та витримати не менш ніж 30 хвилин у при кімнатній температурі. Потім еритроцити осадити центрифугуванням при 1500 об/хв. На протязі 3-5 хвилин. Сироватку декантують та використовують для повторної реакції. - на спонтанну аглютинацію еритроцитів до двійного об'єму розчину №1 додати 0,05 см3 або 0,025 см3 1% суспензію еритроцитів. Спонтанна аглютинація повинна бути відсутньою. - контроль активності позитивної та негативної сироваток - в лунки одного ряду мікропанелі внести 0,05 см3 або 0,025 см3 розчину №1 в перші лунки додати рівні об'єми специфічної та негативної сироватки, пропіпетувати три рази та приготувати послідовні двократні розведення з 1:2 до 1:4096. після цього в лунки внести робочу дозу антигену у вибраному об'ємі для постановки реакції, струшують та залишають для контакту на протязі 30 хвилин за кімнатної температури (18-22°С) або 60 хвилин за температури 2-8°С, після чого в кожну лунку додають 0,05 см3 або 0,025 см3 1% суспензію еритроцитів. Контрольна позитивна сироватка повинна гальмувати гемаглютинуючу активність 4ГАЕ антигену в титрі, що вказаний на етикетці флакону з позитивною сироваткою з похибкою в одне розведення. Негативна сироватка повинна гальмувати гемаглютинуючу активність 4ГАЕ антигену в титрі, що менший за 1:4. 4.5.3 Облік результатів реакції облік результатів реакції проводять візуально після повного осідання еритроцитів в контрольних лунках (у вигляді "ґудзика"). Титром сироватки вважають найбільше її розведення, в котрому повністю відсутня аглютинація еритроцитів антигеном. Спосіб виготовлення набору для виявлення специфічних антитіл до параміксовірусів І, II та III серотипІв в реакції затримки гемаглютинації може знайти застосування в лабораторіях ветеринарної медицини при діагностичних дослідженнях, а також на біологічних підприємствах, які виготовляють імунобіологічні препарати. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601