Спосіб виявлення специфічних антитіл до збудника фузобактеріозу (некробактеріозу) методом імуноферментного аналізу у крові тварин

Спосіб виявлення специфічних антитіл до збудника фузобактеріозу Fusobacterium necrophorum методом імуноферментного аналізу, що включає використання набору діагностичних компонентів, який відрізняється тим, що містить антиген F. necrophorum (поверхнево-активні видоспецифічні пептиди клітинної стінки збудника), одержаний шляхом лужного гідролізату, очищений і концентрований, облік результатів автоматизований. (19) (21) u200910990 (22) 30.10.2009 (24) 12.04.2010 (46) 12.04.2010, Бюл.№ 7, 2010 р. (72) ГАЛКА ІГОР ВАСИЛЬОВИЧ, РИЖЕНКО ВАСИЛЬ ПЕТРОВИЧ, СКРИПНИК ВАЛЕРІЙ ГРИГОРОВИЧ, ГОРБАТЮК ОЛЬГА ІВАНІВНА, АНДРІЯЩУК ВАЛЕНТИНА ОЛЕКСАНДРІВНА, РУДОЙ ОЛЕКСІЙ ВАСИЛЬОВИЧ (73) ІНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК 3 аглютинації візуально, а її інтенсивність визначають в хрестах. Показники реакції аглютинації в пробірках на чотири, три або два хрести характеризуються як позитивна реакція. Останнє розведення сироватки, в якому спостерігається аглютинація з оцінками на два, три або чотири хрести, вважають її титром. Недоліком вказаного методу є те, що він тривалий (24 години), недостатньо чутливий та специфічний. 2. Суть реакції гальмування гемаглютинації заключається в тому, що антиген F.necrophorum взаємодіє зі специфічними антитілами досліджуваного матеріалу (сироватки крові) утворюючи комплекс антиген-антитіло, який візуально реєструється утворенням осаду у вигляді "ґудзика". У випадку відсутності специфічних антитіл до збудника фузобактеріозу спостерігається явище гемолізу еритроцитів крові барана (осідання еритроцитів у вигляді чітко вираженої парасольки), Використання реакції затримки гемаглютинації дозволяє протягом 3-3,5 годин ідентифікувати F.necrophorum. Ця реакція доступна для використання у більшості лабораторій [1]. Але для здійснення даної реакції потрібно попереднє культивування культури, яку використовуємо в реакції в якості антигену, на МППБ з 0,5% глюкози під шаром вазелінової оливи протягом 24 годин, що затримує отримання результату. Згадана реакція затримки гемаглютинації здійснюється таким чином. Беруть звичайні полістиролові планшети з лунками, в які вносять такі реагенти: контроль фізрозчину : 0,6см3 фізрозчину; контроль імунної сироватки: 0,55см3 фізрозчину і 0,05см3 імунної сироватки; контроль нормальної (негативної) сироватки: 0,55см3 фізрозчину і 0,05см3 нормальної сироватки крові кроля; 3 контроль гемаглютинації: 0,55см фізрозчину і 3 9 0,05см (5*10 мк.) суспензії антигену F.necrophorum; контроль гальмування гемаглютинації: 0,55см3 фізрозчину, 0,05см3 5-мільярдної суспензії основного антигену та 0,05см3 імунної сироватки; дослід гемаглютинації: 0,55см3 ізрозчину, 0,05см3 5-мільярдної суспензії антигену F.necrophorum; дослід гальмування гемаглютинації: 0,50см3 фізрозчину, 0,05см3 5-мільярдної суспензії антигену F.necrophorum та 0,05см3 імунної сироватки. Вміст лунок перемішують. Планшети залишають при кімнатній температурі на 30хв, а потім у кожну лунку додають по 0,4см3 суспензії еритроцитів і вміст знову перемішують. Планшети накривають поліетиленовою плівкою і залишають на 2год. при (22±1)°С, а потім враховують реакцію за чотирьохбальною системою: Облік результатів досліду. Контроль фізрозчину, імунної сироватки, нормальної сироватки та дослід затримки гемаглютинації - має бути негативним. Контроль гемаглютинації та дослід гемаглютинації - має бути позитивним. 48956 4 Недоліком вказаного методу визначення антитіл є те, що він недостатньо чутливий та специфічний, а також для проведення реакції потрібно мати постійно свіжу вирощену культуру збудника (Культивування протягом 24 годин), постійну наявність тварин-донорів для отримання еритроцитів крові та Ін. В основу корисної моделі, що передбачається, поставлено завдання розробити більш чутливий спосіб виявлення специфічних антитіл до збудника фузобактеріозу F.necrophorum шляхом виготовлення набору діагностикумІв для імуноферментного аналізу, який дасть можливість уникнути перелічених недоліків 1 та 2 прототипів [2]. Поставлене завдання вирішується завдяки тому, що для постановки експресного методу (2-3 години) імуноферментного аналізу використовується очищений і концентрований фузобакТеріозний антиген. За даними параметрами рішення, що заявляється відповідає критерію "суттєві ознаки". Суть корисної моделі антиген, одержаний в результаті культивування збудника фузобактеріозу F.necrophorum на середовищі Кітта-Тароцці, отримання поверхневоактивних видоспецифічних пептидів клітинної стінки збудника, очищення і концентрування яких здійснюють, використовуючи гель-фільтрацію, електрофорез; електроперенесення та імуноіндикацію білків, ультрафільтрацію. Висока чутливість і специфічність способу з використанням методу імуноферментного аналізу (ІФА) досягається шляхом використання очищених від сторонніх білків концентрованих антигенів, попередньо підібраних параметрів тест-системи, а саме: сенсибілізуючої дози антигену, рН інкубаційного буферного розчину, часу й температури адсорбції антигену на твердофазному носії. Після одержання очищених, концентрованих поверхневоактивних видоспецифічних пептидів клітинної стінки F.necrophorum використовували їх для сенсибілізації полістиролових мікропланшет робочим розведенням 1:1000 в умовах 0,01м калій-фосфатного буферного розчину з 0,15М NaCIрН 7,1-7,4, протягом 18 годин при 14°С. Для блокування вільних сорбційних зон після адсорбції очищеного антигену використовували 3% розчин альбуміну. Одержані таким чином сенсибілізовані мікропланшети використовують при виготовленні набору діагностикумів для імуноферментного аналізу при діагностиці фузобактеріозу (некробактеріозу) тварин. Сенсибілізовані планшети можуть використовуватись протягом двох років. Розроблений діагностичний набір включає: полістиролові мікропланшети, сенсибілізовані очищеним антигеном поверхневоактивних видоспецифічних пептидів клітинної стінки F.necrophorum, сироватка крові позитивна до антигену F.necrophorum, сироватка крові негативна, антивидовий імунопероксидазний кон'югат та індикаторна система (ортофенІлендіамін). Використання набору для виявлення антитіл до збудника фузобактеріозу F.necrophorum методом імуноферментного аналізу. У лунки планшет, що сенсибілізовані фузобактеріозним антигеном (ряд А) вносять по 0,1см3 5 48956 позитивної, (ряд В) негативної до фузобактеріозу та у (ряди С,O,Е,Р,O,Н) дослідні сироватки крові тварин. Потім їх розтитровують методом подвійних розведень, інкубують у термостаті 1 годину при і 37°С. Після цього планшети відмивають твінфосфатно-буферним розчином (ТФБР) та вносять по 0,1мл антивидового імунопероксидазйого кон'югату, знову інкубують 1 годину за температури 37°С і вдруге відмивають ТФБР та вносять субстратний розчин (ортофенІлендіамін), спостерігають за забарвленням ферментативної реакції. При досягненні забарвлення позитивного контролю реакції зупиняють додаванням до кожної лунки по 30-35мкл стоп-реагенту (2М розчин H2SO4), після чого проводять облік реакції за допомогою автоматичного спектрофотометра або візуально за інтенсивністю забарвлення ферментативної реакції. При обліку реакції ІФА на спектрофотометрі, якщо показник оптичної щільності вище 0,2 - реакція позитивна. Експериментальні дослідження свідчать, що розроблений спосіб з набором діагностикумів для ІФА являється високочутливим, специфічним, тривалість дослідження 2-3 години; використання сенсибілізованих планшет дає можливість проводити масові обстеження господарств з лікувальнопрофілактичною метою. Спосіб постановки реакції з використанням набору автоматизований і не трудомісткий. Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 6 Таким чином розроблений спосіб виявлення специфічних антитіл до збудника фузобактеріозу F.necrophorum методом імуноферментного аналізу, з використанням розробленого набору діагностикумів, дає можливість за 2-3 години провести діагностику захворювання тварин на фузобактеріоз (некробактеріоз), реакція високочутлива, специфічна, облік реакції автоматизований, може застосовуватись при масових діагностичних обстеженнях господарств. Спосіб знайде застосування у виробничих лабораторіях ветеринарної медицини та науководослідних установах, а також в господарствах при проведенні оздоровчих заходів від фузобактеріозу (некробактерІозу) тварин. Джерела інформації: 1. Методи діагностики некробактерІозу сільськогосподарських тварин: Методичні рекомендації / В.П.Риженко, Г.Ф.Риженко, М.С.Павленко, П.К.Бойко, М.В.Темний, О.М.Марченко, С.А.Дементєва, Т.О.Бондар, І.В.Галка, О.В.Ложкіна.- Київ, 2003.-47с. 2. Практичний посібник з імуноферментного аналізу / Н.В.Іванська, О.М.Кислих, О.В.Максименок, Т.А.Сергеєви та ін. Під ред. Проф. А.Л.Гураля та М.Я.Співака.- Київ, 2003. 50с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601