Спосіб визначення генотоксичності компонентів агроландшафту

Спосіб визначення генотоксичності компонентів агроландшафту, що включає відбір наважок 3 певну частину мутаційних подій, так звані мутації типу «зсуву рамки зчитування» та «заміни пар основ» [1]. Зрозуміло, що пошкодження генетичного апарату не вичерпуються тільки цими двома типами порушень, а отже роздільна здатність цього методу не стовідсоткова. Крім того, проукаріотичні та еукаріотичні організми значно відрізняються один від одного своєю системою метаболізму, а отже і шляхами сприйняття та повними картинами відповіді на вплив одного і того самого чинника. Іншими словами, результат, отриманий на мікроорганізмах, не може бути прямо перенесений на багатоклітинні види. В експерименти з тестування на генотоксичність in vivo залучають так звані модельні організми. Серед рослинних організмів найбільш поширеним є так званий allium-test [4]. Насінню цибулі Аllium сера дають проростати на фільтрувальному папері, змоченому розчинами, приготовленими за участі досліджуваних факторів. Аналіз хромосомних аберацій проводять на давлених препаратах меристеми цих корінців. Таким чином даний метод дає змогу враховувати частоту хромосомних перебудов, тоді як всі інші мутації та пошкодження ДНК залишаються поза межами його роздільної здатності. Одним з методів визначення мутагенної активності факторів зовнішнього середовища є мікроядерний тест, суть якого полягає у визначенні частоти інтерфазних клітин з мікроядрами [4]. Мікроядра - це вторинні ядра, що утворилися під час телофази мітозу з хроматину, що затримався в анафазі внаслідок хромосомних поламок або дисфункції веретена поділу. У першому випадку мікроядра містять ацентричні фрагменти, у другому цілісну хромосому. У мікроядерному тесті застосовують різні об'єкти від риб до людини. Звичайно, в таких дослідження людина може виступати лише біомаркером. Що ж стосується різних видів риб (короп, наприклад) то у них для аналізу зазвичай беруть тканини плавників, зябер або кров [5,6]. Таким чином даний метод дозволяє врахувати тільки втрати певної частини хроматину, тоді як увесь спектр пошкоджень, який не пов'язаний з таким явищем, залишається поза увагою дослідника. Крім того, всі описані способи визначення генотоксичності за допомогою живих організмів, надаючи переконливі результати, потребують високого рівня технічного забезпечення та кваліфікаційного рівня, значної кількості часу та фінансових затрат. З погляду на вищезазначене в нашій країні не розроблено універсального, доступного у використанні методу для визначення сумарної генотоксичності компонентів агроландшафту. На нашу думку найбільш перспективним модельним організмом для тестування генотоксичності в агроландшафті є Drosophila melanogasterплодова або оцтова муха. Цей вид є космополітом, тобто зустрічається у всіх куточках земної кулі, де їй дозволяє температурний режим [7]. Отже слід визнати, що вона є звичним компонентом екосистем, в тому числі і антропогенноперетворених. Дрозофіла є об'єктом генетичних, 53942 4 досліджень вже більше 100 років, як в силу біологічних особливостей цього виду, так і, особливо останні десятиліття, з причини всебічної вивченості цього організму аж до сиквенування геному. Крім того, Drosophila melanogaster є зручним об'єктом для тестування генотоксичності в силу її дешевизни в утриманні, простоти в роботі, можливості отримання достатньої кількості потомків для аналізу. Найближчим аналогом є спосіб визначення генотоксичності за допомогою тесту "Частота аберантних хромосом" в меристематичних клітинах фітоіндикаторів, серед яких найчастіше застосовують Аllium сера L., наведений в Методичних рекомендаціях, затверджених наказом МОЗ України 13.03.2007 № 116 [4]. Згідно цього способу насіння цибулі пророщують протягом 72 годин за температури 25°С при безпосередньому контакті з досліджуваним ґрунтом чи водою. В якості контролю використовують дистильовану воду. При появі первинних корінців довжиною 7-9 мм їх фіксують в ацетоалкоголі за Карнуа [4] і зберігають до остаточного приготування препарату у розчині етанолу 70-відсоткової концентрації. Фарбування препаратів для подальшого дослідження шляхом мікроскопування проводять реактивом Шиффа за Фьольгеном [4]. Під час мікроскопування препаратів враховують клітини з аберантними (патологічними) хромосомами. Частота патологічних анафаз і телофаз розраховується у відсотках від переглянутих аналогічних фаз мітозу. Значним недоліком цього способу є можливість врахування тільки мутацій типу хромосомних перебудов, які в живих організмах у більшості випадків елімінуються і не передаються наступним поколінням. А увесь інший спектр мутацій, який дійсно складає генетичний тягар виду, а саме кількість та генетичний зміст накопичених видом мутацій в низці поколінь, і визначає можливість його виживання в мінливих умовах оточуючого середовища, не може бути врахованим за допомогою цього способу. Крім того, застосування allium-тесту дає можливість враховувати генетичні події, які відбуваються в поколіннях соматичних клітин, які забезпечують виживання конкретного організму (соми), а для виду в цілому визначальними є події, які відбуваються в генеративних клітинах і саме тому успадковуються з покоління в покоління, і означає, що пошкодження, яке виникло в одному організмі під впливом певного чинника, може зашкодити багатьом особинам, представникам наступних поколінь. В основу корисної моделі поставлено задачу визначати генетичну токсичність компонентів агроекосистеми шляхом встановлення частоти летальних, зчеплених зі статтю мутацій у Drosophila melanogasher. Тобто визначати всі, як рецесивні, так і домінантні летальні мутації, в тому числі хромосомні аберації, які виникають в генеративних тканинах мух за контакту з основними компонентами агроекосистеми: ґрунтом, природними водами, рослинницькою продукцією, що дозволить виявляти негативний вплив трансформації довкілля 5 53942 у агроландшафтах вже на первинних ланках трофічного ланцюга. Поставлена задача має реальне рішення, оскільки зменшення кількості самців порівняно з самками залежить від будь-якої з подій в статевій хромосомі, які в гемізиготному стані виявляються летальними. Генотоксичність ґрунту, природних вод, рослинницької продукції, що є компонентами конкретної агроекосистеми пропонуємо визначати способом, наведеним нижче. Для Drosophila melanogasher готують поживне середовище за участю досліджуваних чинників. При цьому твердим компонентом є манна крупа, а в якості рідкої основи залежно від різновиду об'єкту дослідження застосовують: 1) відібрані у агроландшафті зразки природних вод - за аналізування природних вод; 2) водну витяжку з відібраних у агроландшафті зразків ґрунту - за аналізування ґрунтів; 3) розчин соку рослин - за аналізування сирого рослинного матеріалу. Контролем у всіх трьох випадках є поживне середовище на основі з дистильованої води. При аналізуванні сухого рослинного матеріалу (зерно, сіно тощо) готують поживне середовище, в якому рідкою основою є дистильована вода, а твердим компонентом сухий розмелений рослинний матеріал. Мух лінії дикого типу розміщують у ємності з поживним середовищем із розрахунку 5 самок та 2 самці на об'єм 100 мл, щільно накриваючи пробірки пробками, виготовленими з вати. Самців, які розвинулись на цьому середовищі, а отже зазнали впливу досліджуваного фактора, разом із самцями, які розвивались на контрольному середовищі, схрещують із незайманими самками лінії C(1)DX. Незайманих самок для схрещування отримують з культур, які підтримуються в лабораторії шляхом видалення із пробірок, в яких почали з'являтися представники нового покоління, всіх дорослих (імаго) особин. Через 7 годин всі дорослі самки, які знову вилупляться з пупаріїв за цей час в цих пробірках, будуть незайманими і можуть бути використанні для схрещування з піддослідними самцями. Лінія C(1)DX представлена самками із фізично щепленими X-хромосомами. В потомстві таких Комп’ютерна верстка І.Скворцова 6 самок сини завжди нестимуть Х-хромосому батьківського самця. Тому, всі летальні мутації, які виникнуть в цій хромосомі у батька, призведуть до загибелі самців, представників першого покоління, які несуть ці мутації. В наслідок схрещування самок лінії C(1)DX з самцями дикого типу завжди з'являються тільки особини двох типів: самці дикого типу та самки із щепленими X - хромосомами. Порівнюючи частку самців, які розвинулись у контролі та на досліджуваному середовищі виявляють зміну частоти виникнення летальних мутацій. При порівнянні застосовують статистичний метод критерій Фішера F (для якісних ознак). Розрахунки проводять згідно загальновизнаних методик [8]. Якщо отримане число більше або дорівнює табличному, то різниця вважається вірогідною, а тестований компонент агроландшафту генотоксичним. Літературні джерела 1. The International Organization for Standardization (ISO) testing in ISO 10993-3: "Tests for Genotoxicity, Carcinogenicity, and Reproductive Toxicity." 2. Єрмакова Н.Ю. Застосування експресних біологічних методів в еколого-гідрогеологічних дослідженнях // Автореф. дис. канд. геол. наук: 04.00.06.- К., 2000. -20 с. 3. Білявський Г.О., Бутченко Л.І. Основи екології:теорія та практикум: Навч. Посіб. - К.: Лібра, 2004.- 368с. 4. МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ "Обстеження та районування території за ступенем впливу антропогенних чинників на стан об'єктів довкілля з використанням цитогенетичних методів" // Наказ МОЗ України, 13.03.2007 N116. 5. Архипчук В.В., Гаранько Н.М., Гончарук В.В. Спосіб оцінки генотоксичності водного середовища. Патент України № 67315 від 15.02.2006. 6. Архипчук В.В., Малиновская М.В. Применение комплексного подхода в биотестировании природных вод // Хімія і технологія води. - 2000. 22. - № 4. С 428-443. 7. Медведев Н.Н. Практическая генетика. М.: Наука, 1966. 238 с 8. Атраментова О.О., Утєвська О.М. Статистичні методи в біології. Харків: ХНУ імені В.Н. Карабіна, 2007.-С. 135, 136, 262. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601