Спосіб культивування оваріальної тканини пацюків

Спосіб культивування оваріальної тканини пацюків шляхом видалення органа в асептичних умовах, механічного подрібнення і відмивання від крові розчином Хенкса з подальшим розміщенням у суміші для диспергування та інкубуванням, потім відмиванням від суміші для диспергування, розміщенням у культуральну суміш і культивуванням 5-7 діб, який відрізняється тим, що як компоненти суміші для диспергування використовують середовище 199, 0,25% розчин трипсину, розчин версену у співвідношенні 1 1 1 і гентаміцин із розрахунку 10 мкг/мл, фрагменти тканини шкубують протягом 1 години при температурі 34 - 36°С, потім вдруге відмивають і вміщують на культуральну суміш складу середовище 199, середовище Ігла MEM, ETC у співвідношенні 4,5 4,5 1 з додаванням гентаміцину із розрахунку 10 мкг/мл, подальше культивування проводять 2 доби при температурі 36 - 37°С, а потім ще 5 діб при температурі 24 - 26°С Спосіб культивування оваріальної тканини пацюків, який заявляється, відноситься до області медицини, зокрема до досліджень в експериментальній медицині і може бути використаний для розробки культивування тканин руйнування оваріальних фолікулів зі зниженням або втратою їх функціональної активності внаслідок диспергування, недостатня міра захисту культури від інфекційних агентів у зв'язку з використанням пеніциліну, до якого більшість мікроорганізмів резистентна, а також недостатня фрагментація тканини через включення до складу суміші шактивованої бичачої сироватки, яка є інгибітором трипсину В основу винаходу поставлена задача створення способу культивування оваріальної тканини пацюків шляхом видалення органу, потім механічного подрібнення з подальшим приміщенням у суміш для диспергування складу середа 199, 0 25% розчин трипсину, розчин версену у співвідношенні 1 1 1 з доданням гентаміцину з розрахунку 10мкг/мл, подальшим інкубуванням при температурі 34-36*С протягом 1 години, після чого культуру відмивають від суміші для диспергування середою 199 трикратно і переносять на культуральну суміш складом суміш 199, середа Ігла MEM, ембріональна теляча сироватка (ETC) у співвідношенні 4 5 4 5 1 з доданням гентаміцину із розрахунку 10мкг/мл та шкубують протягом 2 діб при температурі 36-37*С, а потім ще 5 діб при температурі 24-26*С, що надає можливість отримувати функціонально активну, досить подрібнену і вільну від інфекційних в КЛІНІЧНІЙ медицині Найбільш близьким по технічній суті до способу, що заявляється, є спосіб культивування оваріальної тканини пацюків [1 Тронько Н Д Рибаков СІ , Коміссаренко І В Лікування хронічного ппокортицизму методом трансплантації культури клітин кори надниркових залоз / Методичні рекомендації, Київ, 1990] шляхом видалення органу в асептичних умовах, механічного подрібнення і від миття від крові розчином Хенкса з подальшим приміщенням фрагментів тканини у суміш для диспергування та інкубацією, потім від миттям від суміші для диспергування, приміщенням культури у культуральну суміш і подальшим культивуванням протягом 5-7 діб При цьому використовували суміш для диспергування складу середа 199, 0 25% розчин трипсину у співвідношенні 1 1 5 з доданням инактивованної бичачої сироватки і пеніциліну із розрахунку 100ОД/мл, а культивування проводили при ПОСТІЙНІЙ температурі 37*С Недоліком відомого способу є вірогідне ю ю ю 54255 агентів культуру оваріальної тканини пацюків із низькою імуногенністю Суть способу культивування оваріальної тканини пацюків полягає в тому, що для культивування оваріальної тканини пацюків яєчники пацюків видаляють в асептичних умовах, потім механічно подрібнюють і відмивають від крові розчином Хенкса, після чого фрагменти тканини вміщують в суміш для диспергування складу середа 199, 0 25% розчин трипсину, розчин версену в співвідношенні 1 1 1 з доданням гентаміцину із розрахунку 10мкг/мл та шкубують протягом 1 години при температурі 34-36*С з подальшим відмиггям культури оваріальної тканини пацюків від суміші для диспергування розчином Хенкса і приміщенням культури оваріальної тканини пацюків у культуральну суміш складу середа 199, середа Ігла MEM, ETC в співвідношенні 4 5 4 5 1 з доданням гентаміцину із розрахунку 10 мкг/мл, після чого культуру оваріальної тканини пацюків культивують протягом 2 діб при температурі 36-37*С, а потім ще 5 діб при температурі 24-26*С Функціональну активність культури оваріальної тканини пацюків визначають шляхом визначення концентрації естрадюлу-17бета (Е2) за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА), культуру вважають функціонально активною якщо концентрація естрадюлу-17бета (Е2) становить 0 11нмоль/л і вище Новим у способі, що заявляється, є те, що в якості компонентів суміші для диспергування використовують середу 199, 0 25% розчин трипсину, розчин версену в співвідношенні 1 1 1 і гентаміцин із розрахунку 10мкг/мл, фрагменти тканини шкубують протягом 1 години при температурі 34-36*С, потім вдруге відмивають і вміщують у культуральну суміш складу середа 199, середа Ігла MEM, ETC у співвідношенні 4 5 4 5 1 із доданням гентаміцину із розрахунку 10мкг/мл, подальше культивування проводять 2 доби при температурі 36-37*С, а потім ще 5 діб при температурі 24-26*С Використання розчину версену як одного з компонентів суміші для диспергування та культуральної суміші дозволяє добитися ретельного розділення тканини на фрагменти і видалення продуктів ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ КЛІТИН, ОСКІЛЬКИ розчин версену потенціює дію розчину трипсину Використання гентаміцину надає можливість знищення більш широкого спектра інфекційних агентів, і в той же час концентрація антибіотика, що використовується, є порівняно малотоксичною для клітин культури Культивування при температурі 24-26*С забезпечує зниження імуногенности культури оваріальної тканини пацюків І тривале збереження и функціональної активності Спосіб реалізують таким чином Після забою здорових пацюків -донорів за допомогою гільйотинування в асептичних умовах видаляють яєчники, протягом 5 хв подрібнюють очними ножицями, після чого трикратно відмивають розчином Хенкса і вміщують фрагменти тканини у стерильний флакон МІСТКІСТЮ ЮОМЛ, ЩО МІСТИТЬ суміш для диспергування складу середа 199 20мл, розчин версену - 20мл, 0 25% розчин трипсину - 20мл і гентаміцин бООмкг, потім вміщують флакон у термостат та шкубують протягом 1 години при температурі 36-37*С, при цьому струшують флакон кожні 15-20хв, потім відмивають тричі середою 199 при температурі 3637*С, після чого відмитий клітинно-тканинний матеріал переносять у флакон МІСТКІСТЮ 500МЛ З культуральною сумішшю складу середа 199 22 5мл, середа Ігла MEM 22 5мл, ETC 5мл, гентаміцин 50мкг, потім флакон вміщують у термостат і культивують при температурі 36-37*С протягом 2 діб, а потім ще 5 діб при температурі 24-26*С, після закінчення терміну інкубації в надосадковій рідині визначають концентрацію естрадюлу-17бета (Е2) за допомогою методу ІФА для оцінки функціональної активності культури оваріальної тканини пацюків Внаслідок використання розчину версену отримують високодисперсну культуру оваріальної тканини пацюків, додання гентаміцину до середи для диспергування та до культуральної середи забезпечує ретельне очищення культури оваріальної тканини пацюків від інфекційних агентів, а культивування при температурі 24-26*С дозволяє знизити імуногенність культури оваріальної тканини пацюків та знизити ризик виникнення реакцій відторгання трансплантанту після трансплантації такої культури оваріальної тканини пацюків, Приклад 1 Після забою 10 здорових пацюківдонорів під ефірним наркозом за допомогою гільйотинування в асептичних боксових умовах видалили яєчники, відмили розчином Хенкса, потім протягом 5хв подрібнювали за допомогою очних ножиць, після чого тричі відмили від крові розчином Хенкса, ВІДМИТІ фрагменти тканин вмістили у флакон МІСТКІСТЮ ЮОМЛ, ЩО МІСТИТЬ 20мл середи 199, 20мл 0 25% розчину трипсину, 20мл розчину версену і бООмкг гентаміцину, потім флакон вмістили в термостат та шкубували 1 годину при температурі 36-37*С, при цьому флакон струшували кожні 15-20хв, після закінчення терміну інкубації культуру оваріальної тканини пацюків тричі відмили від суміші для диспергування середою 199 при температурі 3637*С, після чого вмістили у флакон МІСТКІСТЮ 500мл, що містить 22 5мл середи 199, 22 5мл середи Ігла MEM, 5мл ETC та 500мкг гентаміцину з подальшим приміщенням флакона у термостат і культивуванням 2 доби при температурі 36-37*С і потім ще 5 діб при температурі 24-26*С, після закінчення терміну культивування в надосадковій рідині визначили концентрацію ест радіолу 17бета (Е2) методом ІФА, отримали результат 0126нмоль/л і вважали культуру оваріальної тканини пацюків функціонально активною Приклад 2 Після забою 1 здорового пацюкадонора під ефірним наркозом за допомогою гільйотинування в асептичних боксових умовах видалили яєчники, відмили розчином Хенкса, потім протягом 5 хв подрібнювали за допомогою очних ножиць, після чого тричі відмили від крові розчином Хенкса, ВІДМИТІ фрагменти тканин вмістили у флакон МІСТКІСТЮ 20МЛ, ЩО МІСТИТЬ 5МЛ середи 199, 5мл 0 25% розчину трипсину, 5мл 54255 розчину версена і 150мкг гентаміцину, потім флакон вмістили у термостат та шкубували 1 годину при температурі 36-37*С, при цьому флакон струшували кожні 15-20хв, після закінчення терміну інкубації культуру оваріальної тканини пацюків тричі відмили від суміші для диспергування середою 199 при температурі 3637*С, після чого вмістили в стерильну бактеріологічну пробірку, що містить 5мл середи 199, 5мл середи Ігла MEM, 1 2мл ETC і 112мкг гентаміцину з подальшим приміщенням пробірки в термостат і культивуванням 2 доби при температурі 36-37*С і потім ще 5 діб при температурі 24-26*С, після закінчення терміну культивування в надосадковій рідині визначили концентрацію ест радіолу - 17бета (Е2) методом ІФА, отримали результат 0 151нмоль/л і вважали культуру оваріальної тканини пацюків функціонально активною Приклад 3 Після забою 10 здорових пацюківдонорів під ефірним наркозом за допомогою гільйотинування в асептичних боксових умовах видалили яєчники, відмили розчином Хенкса, потім протягом 5хв подрібнювали за допомогою очних ножиць, після чого тричі відмили від крові розчином Хенкса, ВІДМИТІ фрагменти тканин вмістили у флакон МІСТКІСТЮ ЮОМЛ, ЩО МІСТИТЬ 20мл середи 199, 20мл 0 25% розчину трипсину, 20мл розчину версена і бОмкг гентаміцину, потім флакон вмістили на водяну баню на Юхв при температурі 130*С, при цьому флакон струшували кожні Юмін , після закінчення терміну інкубації культуру оваріальної тканини пацюків тричі відмили від суміші для диспергування середою 199 при температурі 36-37*С, після чого вмістили у флакон МІСТКІСТЮ 500мл, що містить 22 5мл середи 199, 22 5мл середи Ігла MEM, 5мл ETC і 500мкг гентаміцину з подальшим приміщенням флакону у термостат і культивуванням 7 діб при температурі 36-37*С, після закінчення терміну культивування в надосадковій рідині визначили концентрацію ест радіолу - 17бета (Е2) методом ІФА, отримали результат 0 087нмоль/л і вважали культуру оваріальної тканини пацюків недостатньо функціонально активною Використання заявленого способу культивування оваріальної тканини пацюків дозволяє отримати очищенну, високодисперсну культуру оваріальної тканини пацюків, яка зберігає свої функції при істотному зниженні и імуногенности Це дозволяє чекати позитивний ефект від трансплантації такої культури оваріальної тканини з метою замісношої гормональної терапії при низькому ризику виникнення шфекційно-токсичних ускладнень і реакцій відторгання трансплантанту Джерела інформації 1 Тронько Н Д , Рибаков С І , Коміссаренко І В Лікування хронічного ппокортицизму методом трансплантації культури клітин кори надниркових залоз//Методичні рекомендації, Київ, 1990 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24