Спосіб культивування тканини кукурудзи

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию тканей растений in vitro. Целью изобретения является повышение индукции каллусообразования и регенерационной способности. Способ состоит в том, что перед перенесением зародышей на модифицированную твердую питательную среду Мурасиге-Скуга производится дополнительное инкубирование их в той же жидкой питательной среде, в которую в качестве стимулятора каллусообраэован*ия вводят 1,4диазоцетилбутан в количестве 110 мг/тт. 2 табл. рованную твердую питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) производят дополнительное инкубирование лх в той же жидкой питательной среде, в которую в качестве стимулятора каллусообразбвания вводят 1,4-бисдиазоацетилбутан (ДАБ) в количестве 1-10 мг/л (ДАБ известен как мутаген). Проведенные исследования показали возможность использования его как стимулятор каллусообразования. Способ осуществляется следующим образом. После стерилизации и промывки початков вычлененные незрелые зародьши инкубируют в ієчениє 1 ч в жидкой пита тельной среде МС с ДАЬ. Затем тща І 1507792 тельно трижды'отмывают жидкой питадо 20,68 + 13,79 = 34,47% за счет тельной средой. Для хранения вычлепромежуточной реакции между собственненных зародышей, обработки зародышей но каллусообразованием и прорастаДАБ и отмывки от него используют жиднием: одновременного формирования кую питательную среду, но без 2,4каллуса и недоразвитого побега. Недихлорфеноксиуксусной'кислоты (2,4 Д ) , доразвитый побег отделяют, а оставший'аминокислот и агара. Обработка растся каллус можно культивировать дальворами ДАБ проводится в чашках Петри ше . при комнатной температуре. КультиJQ П р И м е р 4, Условия проведения вируют по два зародыша в пробирках опыта аналогичны описанным в примере с 10 мл среды при 27 + 1°С и 16-ча2, однако количество ДАБ составляет совом фотопериоде. В качестве стиму100 мг/л. Ведущей реакцией является лятора каллусообразования используют промежуточная реакция, собственно ДАБ в количестве 1-100 мг/л среды. 15 каллусообразование составляет 2,85%, Маточный раствор ДАБ стерилизуют что на порядок меньше, чем в примепропусканием через бактерицидный фирах 2 и 3. льтр. Твердая питательная среда для П р и м е р 5. Условия проведения индукции каллуса содержит 0,25 мг/л опыта аналогичны описанным в примере 2,4 Д. 20 1, но возраст незрелых зародышей П р и м е р 1. Незрелые початки скороспелой линии ВС 2923 составляет линии БС2923, взятые на критический 17 дней после опыления. Каллусообра16-й день после цветения, поверхзование отсутствует, наблюдается лишь ностно стерилизуют лабораторным детерпрорастание зародышей. гентом, трижды промывают стерильной 25 П р и м е р 6. Условия проведения водой. Вычленяют из зерновок незрелые опыта аналогичны описанным в примере зародыши, удаляют эндосперм. Далее 2, возраст зародышей 17 дней (табл.2). незрелые зародыши переносят на тверСодержание ДАБ в жидкой питательной дую культуральную среду и размещают среде 1 мг/л. При этом наблюдается щитком вверх. Каллус инициируют и 30 появление каллусообразования, промесохраняют на модифицированной среде жуточной реакции, корнеобразования. МС, содержащей неорганические компоОбщая величина каллусообразования ненты по Мурасиге и Скугу, витамины 21,72 + 3,12 - 24,84%. и аминокислоты по Штраусу, 20 г/л П р и м е р 7. Условия проведесахарозы, 8 г/л агара. Индукция каллусе ния опыта аналогичны описанным в сообразованич достигается при испольпримере 6, однако количество ДАБ сосзовании в качестве стимулятора роста тавляет 10 мг/л. Общая величина калгербицида 2,4 Д в концентрации лусообразовання 13,62 + 6,25 =.21,87%. 0,25 мг/л. Через 28 дней культивироП р и м е р 8. Условия проведения вания проводят учет- Данные представ-40 опыта аналогичны описанным в примере лены в табл.1. Каллусообразование 6, однако количество ДАБ составляет отсутствует, наблюдается лишь про100 мг/л. Общая величина каллусообрарастание зародышей. зования 3,12 + 15,62 « 18,84%. Беду- _ П р и м е р 2. Условия проведения щей реакцией зародышей является проопыта аналогичны описанным в приме^ межуточная, собственно каллусообразоре 1, однако перед посадкой зародышей вание составило 3,12 %, что значительдля культивирования на твердую питано меньше, чем в примерах 6 и" 7. тельную среду, помещают их на 1 ч в П р и м е р 9. Условия проведения жидкую питательную среду, содержащую опыта соответствуют описанным в при1 мг/л ДАБ. Затем трижды отмывают мере 1, но возраст незрелых зародышей жидкой питательной средой без ДАБ. 50 скороспелой линии ВС 2923 составляет При этом наблюдается каллусообразова18 дней после опыления.Каллусообразоние 24,13%, корнеобразование и прование отсутствует, наблюдается лишь растание зародышей. прорастание зародышей. П р и м е р 3. Условия проведения П р и м е р 10. Условия проведений опыта аналогичны описанным в примере опыта аналогичны описанным s примере 2, однако количество ДАБ составляет 2, возраст зародышей 18 дней, содер10 мг/л. При этом наблюдается увежание ДАБ в жидкой питательной среде 1 мг/л. При этом наблюдается появление личение общего каллусообразования 1507792 каллусообразования промежуточной белого плотного каллуса, полученного реакции, корнеобразования. Общая вели-, в основном от ^зародышей, для которых чина каллусообразования 18,75 + 6,25 =• характерна промежуточная реакция между = 25%. собственно каллусообразованием и проП р и м е р 11. Условия проведения растанием. опыта аналогичны описанным в примере Таким образом, предлагаемый способ 2, возраст зародышей ]8 дней, содериндукции каллусообразования из незрежание ДАН 10 мг/л. Общая величина каллых зародышей кукурузы, включающий лусообразования 15,62 + 12,50 = 28,12%,- обработку зародышей перед культивироП р и м е р 12. Условия проведения ванием мутагеном ДАБ в количестве опыта аналогичны описанным в примере 1-10 мг/л более эффективен по сравне2, возраст зародышей 18 дней, содернию с известным, так как позволяет жание ДАБ 100 мг/л. Общая величина увеличить в два раза временной промекаллусообразования 3,12 + 9,37 \*і жуток для введения в культуру незре= 12,49 %. Ведущей реакцией зародылых зародышей кукурузы, обеспечивает шей является промежуточная, собстпри этом изменение спектра ростовых венно каплусообразование 3,12 %, что реакций зародышей определенного воззначительно меньше, чем в примерах раста и получение тотипотентного 10'и 11. 20 каллуса, что возволяет повысит эффек- . тивность селекционной работы на клеТаким образом обработка незрелых точном уровне. зародышей скороспелой линии ВС 2923 ДАБ в количестве 1; 10 и 100 мг/л Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я расширяет спектр ростовых реакций незрелых зародышей критического для 25Способ культивирования ткани кукуданной линии 16-дневного и старшего рузу j включающий вычленение зароды, возраста и обеспечивает возможность шей из простерилизованного початка» •получения каллуса еще в течение 2-3 перенесение их на модифицированную, дней. Кроме наблюдаемых в контроле прорастания и прекращения развития 30 твердую питательную среду МурасигеСкуга, содержащую в качеств.е стизародышей в вариантах с обработкой мулятора каллусообразования 2,4ДАБ отмечены каллусообразованиё, дтглорфеноксиуксусную кислоту, к • промежуточная реакция Сформирование дальнейшее их культивирование, о т одновременно каллуса и недоразвитого л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цепобега), интенсивное корнеобраэование 35 лью повышения индукции каллусообразоКаллус индуцируется двух типов: рыхвания и .регенерационной способности, лый, светло-желтый с участками позеперед нанесением зародышей на твердую ленения , из которого в дальнейшем • питательную среду производят дополнивозможна регенерация растений, т.е. тельное инкубирование их в той же . тотипотентный и плотный компактный 40 жидкой модифицированной питательной 'белый. Образование тотипотентного среде Мурасиге-Скуга, в которую в морфогенного каллуса чаще наблюдается качестве стимулятора каллусообразо-при содержании ДАБ 1 - 10 мг/л. вания вводят 1,4-диазоцетилбутан в При содержании ДАБ 100 мг/л преобколичестве 1-10 мг/л. . .; ладает образование неморфогенного де 507792 Т а б л и ц а 1 Ростовые реакции нечрелых зародышей кукурузы после обработки ДАБ Пример, ДЛБ мг/л мг/л Возраст зародышей, день Каллус а я _р_е акция Каллус + недоразвитый побег Прорастание Корнеобразовсіниє Развития нет 1 0 16 24,П 53,12 425 •0,25 16 2 10,3* 24,13 3 10 0,25 16 20,68 15,79 34,48 31,03 и 100 0,25 16 2,85 25,71 42,85 5 0 0,25 17 6 1 0,25 17 21,72 7 10 0,25 17 е 100 0,25 17 9 0 0,25 13 10 I 0,25 18 18,75 6,25 34,37 3,12 37,51 (1 10 0,25 18 15,02 12,50 37,51 6,25 28,42 12 100 0,25 18 3,12 9,37 40,36 (2,50 34,66 46,87 2,85 25,71 59,38 40,52 3,12 31,25 12,50 31,25 15,62 6,25 25,00 6,25 46,87 3,12 15,62 25,00 56,25 62,50 37,50 Т а б л и ц а 2 Влияние возраста незрелых зародышей линии ВС2923 на индукцию каллусообразовання Каллусообразованне, Данные об изолированных зародышах Длина, мм Возраст, дни 2,0 тui Z Количество 2,4 Д (мг/л) г ---- 0,25 1,0 - 1. 2 15 ,62 40 38 ,12 9 , 36 1,0 - 1 ,5 3 ! ,81 ,ь 15 50 ,00 IS ,18 9 , 09 16 1,5 - 2 ,0 32 ,14 46 .15 17 2,0 - 2 ,5 10 ,71 18 2,5 - 3 ,0 и .53 • * — Составитель В.Демкин Редактор Л.Пчолинская_ _ _ ^Ё^Р^ё М*Моргентал ц'Корректор С.ІІЇекмар Заказ 55?б729 Тираж 50? Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-3 5, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101