Спосіб визначення цитоактивних властивостей речовини в тестовій пробі in vitro

Спосіб визначення цитоактивних властивостей речовини в тестовій пробі in vitro, який включає попередню інкубацію ізольованих клітин крові у розчині речовини, що досліджується, з наступною дією стандартного цитодеструктивного чинника, реєстрацію реакції і аналіз результатів за характером цитодеструктивного процесу, який відрізняється тим, що як клітинний тест-об'єкт беруть завись лейкоцитів нативної крові в об'ємі 0,02-0,05 мл, які шкубують на предметному склі з рівним об'ємом дослідної речовини впродовж 1824 год при 18-20°С в умовах вологої камери, після чого до суміші інгредієнтів на предметному склі вносять 0,02 мл розчину флюорохрому акридину оранжевого в розведенні 1 10000 (рН 6,5), накривають мікропрепарат покривним скельцем і витримують ще ЗО хв при 37°С, після чого досліджують у полі зору люмінесцентного мікроскопа, реєструючи яскравість люмінесценції, характер цитолізу та відсотковий вміст у препараті пошкоджених клітин, а аналіз цитоактивності дослідної речовини здійснюють на основі порівняння результатів контрольного (без внесення дослідної речовини) і дослідного мікропрепаратів Винахід стосується медицини, зокрема біофізики, цитології і алергологи, і може бути використаний в лабораторній практиці і наукових дослідженнях для визначення як цитоактивних властивостей різних речовин, зокрема медикаментозних засобів, так і індивідуалізованої реакції на них з боку імунокомпетентних клітин і організму як цілого Відомий спосіб визначення цитоактивних властивостей речовини в тестовій пробі in vitro, який включає попередню інкубацію ізольованих клітин крові у розчині речовини, що досліджується, з наступною дією стандартного цитодеструктивного чинника, реєстрацію реакції і аналіз результатів за характером цитодеструктивного процесу [1] За відомим способом цитоактивні властивості дослідної речовини, наприклад, медикаментозного засобу, визначають за характером впливу на резистентність мембран клітин, зокрема еритроцитів, в реакції модульованого кислотного гемолізу, причому стандартним цитодеструктором використовують розведену на ізотонічному розчині натрію хлориду соляну кислоту кція клітин під впливом пошкоджувального чинника у вигляді реакції цитолізу відображає лише рівень і характер резистентності клітинних мембран, залишаючи нерозкритими компоненти антиоксидантної системи захисту, перш за все, клітин як структурно-функціональних одиниць живого, так і організму як цілісної системи Крім того, зазначений недолік негативно позначається на якості інформації про антиоксидантні властивості речовини, що досліджується, на повноті виявлення здатності її забезпечувати цитопротекторний ефект В основу винаходу поставлено завдання вдосконалити відомий спосіб, в якому шляхом внесення змін у технологію діагностичної тестової проби, а саме тих, що стосуються вибору чутливішого, ніж у способі-прототипі, клітинного тест-об'єкту, адекватнішого методу дослідження і забезпечення коректних умов (тривалість інкубації, температура та ш) для оптимального прояву генетично детермінованої системи внутрішньоклітинного антиоксидаційного захисту, досягають підвищення інформативності діагностичного дослідження При вирішенні технічного завдання було взято до уваги відомий взаємозв'язок між рівнем пору Недолік відомого способу полягає у недостатньому рівні інформативності, оскільки цитодестру 00 ю ю 55782 шень окисно-відаовного гомеостазу на рівні клітин і всього організму як цілого, з одного боку, і резистентністю клітинних мембран - з другого Так, накопичення в організмі, а отже - в клітинах і їх мікрооточенні продуктів ліпопероксидацм як в результаті функціонального перенапруження метаболічних механізмів, так і їх розладів внаслідок дії патогенних чинників екзогенного і ендогенного походження, зокрема у вигляді вільних радикалів з високим деструктивним потенціалом, супроводжується пошкодженням макромолекул цитомембранних структур, зниженням резистентності клітин Враховуючи при цьому здатність речовин з антиоксидантними властивостями, наприклад, таких як вітаміни А, Е, С, деякі амінокислоти та ІНШІ, гасити люмінесценцію, очевидною є ДОЦІЛЬНІСТЬ методичного поєднання цитолітичного процесу з люмінесценцією клітин, оскільки такий ПІДХІД МІСТИТЬ інформацію про взаємопов'язані процеси резистентності живих клітин і їх антиоксидантний потенціал, з одного боку, та наявність мембраностабілізацшного і антиоксидаційного ефектів дослідної речовини - з іншого Виходячи з наведеного, поставлене завдання вирішують тим, що у відомому способі визначення цитоактивних властивостей речовини в тестовій пробі in vitro, який включає попередню інкубацію ізольованих клітин крові у розчині речовини, що досліджується, з наступною дією стандартного цитодеструктивного чинника, реєстрацію реакції і аналіз результатів за характером цитодеструктивного процесу, ВІДПОВІДНО до винаходу клітинним тест-об'єктом беруть завис лейкоцитів нативної крові в об'ємі 0,02-0,05мл, які шкубують на предметному склі з рівним об'ємом дослідної речовини впродовж 18-24год при 18-20°С в умовах вологої камери, після чого до суміші інгредієнтів на предметному склі вносять 0,02 мл розчину флюорохрому акридину оранжевого в розведенні 1 10000 (рН 6,5), накривають мікропрепарат покривним скельцем і витримують ще ЗОхв при 37°С, після чого досліджують у полі зору люмінесцентного мікроскопу, реєструючи яскравість люмінесценції, характер цитолізу та відсотковий вміст у препараті пошкоджених клітин, а аналіз цитоактивності дослідної речовини здійснюють на основі порівняння результатів контрольного (без внесення дослідної речовини) і дослідного мікропрепаратів Спосіб здійснюють таким чином У стерильну мікропробірку набирають 0,51,0мл крові, стабілізованої 2% розчином натрію цитрату (гепарин для стабілізації крові брати недоцільно, оскільки цей полісахарид надмірно стабілізує КЛІТИННІ мембрани, а отже - вносить суттєві помилки у дослідження) Після 30-40 хвилинного спонтанного осадження лейкоцитів у мікропробірці мірною піпеткою набирають завис лейкоцитів в аутолопчній плазмі крові в об'ємі 0,02-0,05мл, наносять по одній пробі на два краї предметного скла (контроль і дослід) і до однієї з них - дослідної - вносять аналогічний об'єм речовини, що досліджується, після чого мікропрепарат шкубують впродовж 18-24год при 18-20°С в умовах вологої камери, наприклад, у чашці Петрі На наступний день до суміші інгредієнтів на предметному склі в обидва мікропрепарати - контрольний і дослідний - вносять по 0,02мл розчину флюорохрому акридину оранжевого в розведенні 1 10000 (рН 6,5), накривають мікропрепарат покривним скельцем, додатково витримують впродовж ЗОхв при 37°С, після чого досліджують у полі зору люмінесцентного мікроскопу, реєструють яскравість люмінесценції, характер цитолізу та відсотковий вміст в мікропрепараті пошкоджених клітин Висновок про характер цитоактивності дослідної речовини роблять на основі порівняння результатів контрольного і дослідного мікропрепаратів Приклад 1 Свіжоцитратну кров донора в КІЛЬКОСТІ 0,5мл внесли в пробірку і витримували в штативі для седиментації клітин впродовж ЗОхв, після чого за допомогою мірної піпетки завис лейкоцитів в аутолопчній плазмі крові в об'ємі 0,02мл внесли на два краї предметного скла До дослідної краплі крові внесли 0,02мл ербісолу як речовину, що досліджують, після чого мікропрепарат шкубували протягом 20год при 20°С в умовах вологої камери, зокрема, в чашці Петрі Після етапу інкубації до суміші інгредієнтів на предметному склі в обидва мікропрепарати - контрольний і дослідний - внесли по 0,02мл розчину акридину оранжевого в розведенні 1 10000 (рН 6,5), накрили покривним скельцем, додатково витримали впродовж ще ЗОхв при 37°С , після чого досліджували в полі зору люмінесцентного мікроскопу при застосуванні водноімерсійного об'єктиву ВИ-30 Результат оцінювали за рівнем яскравості люмінесценції ядрових структур лейкоцитів, вираженості лейкоцитолізу та відсотковим вмістом у мікропрепараті пошкоджених клітин Результати дослідження цитоактивних властивостей ербісолу занесли в робочу таблицю 1 Таблиця 1 Яскравість люмінесценції ядрових структур ізольованих лейкоцитів Контроль Дослід ++++ ++ Рівень спонтанного (ппоосмолярного) лейкоцитолізу Контроль +++ З наведених у робочій таблиці даних зроблено висновок про наявність у ербісолу виражених мембранопротекторних і антиоксидаційних властивостей, що реалізується підвищеним рівнем резистентності ізольованих лейкоцитів (на 38,1%), Дослід + Показник лейкоцитолізу, % Контроль 84 Дослід 52 покращенням якісних показників люмінесценції і реакції лейкоцитолізу під впливом дослідного препарату Приклад 2 Запропонованим способом проведено дослідження цитоактивності ряду медикаме 5 55782 6 нтозних засобів, у тому числі рослинної природи, результати якого наведеш в таблиці 2 Таблиця 2 Речовини Токоферолу ацетат Вітамін А Аскорбінова кислота Настій листя пнкго Настій кори пнкго Алфлутоп Румалон Яскравість люмінесценції ядрових структур ізольованих лейкоцитів Контроль Дослід Рівень спонтанного (ппоосмолярного) лейкоцитолізу Контроль Дослід Показник лейкоцитолізу, % Контроль Дослід А% +++ + ++ + 79 62 -21,5 +++ ++ ++ + 83 65 -21,7 +++ ++ ++ ++ 76 51 -32,9 +++ + ++ + 91 58 -36,3 +++ + ++ + 88 55 -37,5 +++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ ++ 73 78 61 58 -16,4 -25,6 З наведених у таблиці 2 даних слід зробити висновок про те, що для всіх взятих у дослід речовин характерними є цитопротекторні властивості Разом з тим, рівень стабілізації клітинних мембран і антиоксидаційні властивості у окремих речовин мають суттєві ВІДМІННОСТІ Так, наприклад, мембранопротекторний ефект більш помітний виявився у компонентів, виділених з листя і кори пнкгового дерева, а також під впливом аскорбінової кислоти і румалону, і значно менший - в результаті впливу вітамінів А і Е Аналогічно до зазначеного ефекту спостерігали ефект гасіння люмінесценції, що є свідченням антиоксидаційної активності вказаних речовин Отже, наведений приклад вказує на принципову можливість на основі запропонованого способу дослідити індивідуальну чутливість лейкоцитів як імунокомпетентних клітин до різних речовин, й перш за все, медикаментозних засобів, забезпечує більш високий, у порівнянні з прототипом, рівень інформативності діагностичного цитологічного дослідження Джерела інформації, які слід взяти до уваги 1 Пат 29803 А Україна, Спосіб визначення індивідуальної медикаментозної непереносимості /Оробчук Б Я , Дем'яненко С М , Дем'яненко В В № 97073432 , Опубл 15 1100, Бюл №6-11 Підписано до друку 05 05 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24