Оптичний перетворювач для безпосереднього якісного та кількісного визначення речовини у рідкій пробі

1 Оптичний перетворювач для безпосереднього якісного та КІЛЬКІСНОГО визначення речовини в рідкій пробі складений із джерела р-лолярізованого світла скляної призми повного внутрішнього відбитка з металевою плівкою на якій закріплений хімічно зв'язаний з нею чутливий самоорганізо чутливого шару, яка утворює ХІМІЧНИЙ ЗВ'ЯЗОК ІЗ по Винахід належить до фізико-хімічних методів аналізу зокрема до визначення якісного та КІЛЬКІСНОГО складу досліджуваної рідкої проби з використанням оптоелектронного твердотільного перетворювача поверхня якого модифікована органічною матрицею, що самоорганізується, а принцип ди заснований на резонансі поверхневих плазмонів Такі пристрої, що дозволяють робити швидкий якісний і кількісний аналіз рідких проб, можуть знайти застосування у медицині і сільському господарстві фармацевтичної і харчової промисловості, моніторингу навколишнього середовища, а також для фізико-1 біохімічних досліджень у різноманітних галузях науки Відомий бюсенсор United States Patent 5629213, Analytical biosensor, Steven E Kornguth et al, May 13 1997, G01N 033/543, G01N 033/552, G01N 033/547, робота якого заснована на використанні явища поверхневого плазменного резонансу Система для визначення речовини включає скляну призму, тонку металеву плівку і чутливу плівку багатошарової структури а) тонкий органічний полімерний шар матеріалу, що унаслідок своєї поліанюнної природи адсорбується на металевій ПЛІВЦІ, б) шар полікатюнного полімерного матеріалу полілізину, що зв'язується з поліанюнним і в) ЗОВНІШНІЙ шар біологічної природи, пов'язаний із полілі верхнею, зслотої плівки містить сірку, при цьому одна зі складових чутливого шару є алкантюлом ІЗ довжиною вуглецевоводневого ланцюга більш 9 а друга схлздовз повинна бути структурним анало гом ідентифікованої речовини що містить сірку зином, що забезпечує специфічне зв'язування з речовиною, що визначається Бюсенсор дозволяє виявити присутність у рідкій пробі молекул біологічної природи, для котрих заздалегідь необхідно виробити бюафінних партнерів звязування, і визначити їхню концентрацію Недоліком є те, що утворення чутливого шару відбувається в три стадії, причому використовувані матеріали є полімерними, що потребує операцій центрифугування, контрольованого випару розчинника і попімеризацн, тобто складного і дорогого устаткування Крім того, до складу чутливого шару входять малостабільні дорогі біологічні реагенти імунологічного тестування Метод центрифугування є макроскопічним, він дає неоднорідні і великі по товщині (300 - 400 нм) покриття, що веде до погіршення чутливості і помилкам у розрахунках Відомий пристрій для знаходження і дослідження речовини в рідкій пробі United States Patent 5561069, Surface plasmon resonance detector having collector for eluted ligate, Bngham-Burke et al , Oct 1 1996, G01N 033/543, що використовує явище поверхневого плазмонного резонансу, чутливий елемент якого містить металеву плівку, мо О) со 34994 дифіковану похідними органічної речовини • декстрана Такий пристрій дозволяє контролювати і досліджувати речовини в рідкій пробі, для чого необхідно надходження і закріплення ще однієї речовини що є сполучною між детектованою речовиною Можлива заміна сполучної речовини Недостатком є те, що утворення чутливого шару відбувається в два етапи, що робить цей процес складним і дорогим Крім того великі товщини шару декстрана (більш 100 нм) неможливість одержання плівок однорідних по товщині, неоднорідні умови зв'язування з речовиною що досліджується призводять до не контрольованих помилок у розрахунках Сполучну речовину для кожного випадку необхідно спеціапьно розробляти Найбільше близьким до оптичного перетворювача, що заявляється можна вважати бюсенсор United States Patent 5620850 Molecular recognition at surfaces denvatized with selfassembled monolayers Bamdad, Cynthia С et al, Apr 15 1997, C12O 001/68 G01N 033/53, C07K 005/00 Такий бюсенсор поверхневого плазмонного резонансу являє собою оптичну систему, що містить джерело р-полярізованого світла, скляну призму повного внутрішнього відбитка з метапевою плівкою на ній, що модифікована органічною ппівкою з трьох шарів, де перший шар є самоорганізований і фотоприймач Бюсенсор розпізнає біологічну молекулу завдяки специфічному зв'язуванню з бюафінним партнером що зєднується за допомогою хепатного агента через металевий іон із першим шаром, що є самоорганізованим і закріпленим на металевій поверхні ХІМІЧНИМ зв'язком Недоліком є 3-х стадійна організація чутливої ППІВКИ що робить процес складним і дорогим Крім того отриманий у результаті шар утворюється просторово-неоднорідним що веде до втрати чутливості і помилковихрезультатів Необхідність використання біологічних реагентів імунологічного тестування робить такий чутливий шар дорогим, малостабіпьним і обмежує КІЛЬКІСТЬ об'єктів розпізнавання Таким чином аналіз наведених біохімічних сенсорів робота яких заснована на явищі поверхневого плазмонного резонансу показує, що шари таких оптичних пристроїв не дають оптимального сполучення простого і недорогого методу одержання і відповідної якості (однорідність, товщина) для прямого якісного та кількісного визначення речовини в рідкій пробі В основу винаходу, що заявляється поставлена задача збільшення чутливості, точності здешевлення перетворювача, розширення копа об'єктів розпізнавання при значному спрощенні створення чутпивого шару Поставпена задача досягається тим що в оптичному перетворювачі для прямого якісного та КІЛЬКІСНОГО визначення речовини в рідкій пробі, що містить джерело р-полярізоеаного світла, скляну призму повного внутрішнього відбитка з метапевою плівкою на якій закріплений за допомогою хімічного зв язку самоорганізований моношар орга нічних молекул і фотоприймач пов'язані між собою оптичним зв'язком, що самоорганізований мо ношар утворений із двухкомпонентної системи молекул із різною довжиною вуглецевоводневого ланцюга, одна з яких повинна бути структурним аналогом ідентифікованої речовини Оптичний перетворювач, що заявляється, відрізняється також тим, що металева плівка на поверхні призми є золотою, а функціональна група молекул чутливого шару, утворююча хімічний зв'язок із поверхнею золотої плівки, містить сірку, при цьому одна зі складових чутливого шару може бути алкантюлом із довжиною ланцюга більш 9, а друга складова повинна бути структурним аналогом ідентифікованої речовини, що містить сірку Збільшення чутливості і точності досягається тим, що в оптичному перетворювачі для прямого якісного та кількісного визначення речовини в рідкій пробі чутливий шар є не багатошаровою структурою, а моношаровою матрицею органічних молекул , що самоорганізована Такий моношар, утворений із двухкомпонентної системи молекул із різною довжиною вуглецевоводневого ланцюга, одна з яких є структурним аналогом ідентифікованої речовини, утворюється щільним, однорідним по товщині в області десятків-сотень ангстрем, що створює однорідні умови зв'язування з ідентифікованою речовиною і дозволяє уникнути помилок у розрахунках концентрації Розширення кола об'єктів пов'язане з тим, що для будь-якої цікавлячої речовини хімічної або бюлопчног природи завжди можна організувати чутливу моношарову матрицю, оскільки завжди можна одержати (синтезувати) його аналог спроможний до хімічного зв'язування з металевою подкладинкою Здешевлення випливає зі значного спрощення- методу одержання чутливого шару, що є одностадійним у зв'язку з тим, що поставлена задача детектування вирішується організацією тільки одного моношару Сформувати чутливий шар, запропонований у винаході, що заявляється, можна зануренням призми з металевою плівкою в розчин, що містить двухкомпонентну суміш молекул, на 24-72 години з наступним промиванням у чистому розчиннику і сушінням, на зразку з будь-якою геометрією, при цьому не потрібно складного або дорогого устаткування і спеціальних умов тобто процес відбувається з високим виходом і відтворенням при умовах, характерних для більшості промислових і наукових організацій Оптимальне досягнення поставленої задачі реалізується в оптичному перетворювачі, що заявляється коли металева плівка на поверхні призми є золота, а функціональна група молекул чутливого шару, утворююча ХІМІЧНИЙ ЗВ'ЯЗОК ІЗ поверхнею золотої пшвки, містить сірку Золото вибирається переважним металом через свої інертні властивості що є істотним для роботи рідинного біохімічного сенсору, а функціональна група що містить сірку, є найбільш активною при утворенні ХІМІЧНОГО зв'язку з золотом На фіг 1 наведена резонансна крива поверхневого плазменного резонансу На фіг 2 показана бпок-схема пристрою, що заявляється, де 1 - джерело р-полярізованого світла, 2 - призма з провідниковою плівкой, модифікованою селективною моношаровою органічною матрицей, 3 - блок керування поворотом призми, 4 34Э94 - блок подачі рідкої проби, 5 - фоточутливий елемент, 6 - комп'ютерна система 1 На фіг 3 показана схема організації органічної моношарової матриці на металевій поверхні На фіг 4 наведена експериментальна кінетична крива (сенсорограма) при детектуванні адсорбції барбітурової кислоти на чутливу поверхню оптичного перетворювача, модифіковану моношаровою органічною матрицею (1) - веронал у концентрації 200 г/мл, (2 - В) - барбітурова кислота в діапазоні концентрацій 1 нг/мл - 1 мг/мл. • На фіг 5 наведена експериментальна калібрована крива для кількісного визначення барбітурової кислоти в рідкій пробі в діапазоні концентрацій 1 нг/мл • 1 мг/мл У винаході, що заявляється, оптичний перетворювач для якісного та кількісного визначення речовини в рідкій пробі є сенсорним приладом, робота якого заснована на використанні явища поверхневого плазмонного резонансу (Поверхневі полярітони Електромагнітні хвилі на поверхнях і межах поділу середовищ За редакцією В М Аграновича, ДЛМиллса. М" Наука, 1985, 525с; Поверхневі полярітони в напівпровідниках І діелектриках Н Л.Дмитрук, В Г Литовченко, В Л Стрижевский. Київ' Наукова думка, 1989, 375 с ) Поверхневі електромагнітні хвилі, або поверхневі плазмони (ПП), - особливий вид макроскопічних електромагнітних хвиль, що поширюються уздовж поверхонь поділу середовищ, тобто на відстанях, що не перевищують довжини хвилі використовуваного випромінювання Умовою існування ПП є наявність у робочому діапазоні негативної діелектричної проникності в одного із середовищ, що граничать Для металів діелектрична проникність обумовлена плазмою вільних електронів є негативною в широкому спектральному діапазоні Найбільш частим методом збудження ПП є з використанням призми в умовах порушеного повного внутрішнього відбитка і геометри, при котрій металеву плівку наносять безпосередньо на призму У сенсорному застосуванні робоча сторона призми, покрита тонким металевим шаром і контактує з досліджуваною пробою, опромінюється з боку більш щільного середовища Інтенсивність світла, відчуває повний внутрішній відбиток від межі поділу скло-метал і вимірюється відбиток як функція кута падіння Коли р-полярізовані електромагнітні хвилі збудять поверхневі плазмони на межі поділу метал - досліджувана проба, у залежності, що вимірюється, буде спостерігатися ослаблення повного внутрішнього відбитка і ми зможемо зафіксувати результуючий відгук у виді резонансної кривої (фіг 1). Форма кривої плазменного резонансу і, зокрема, положення мінімуму, залежать як від показника заломлення призми, оптичних констант і товщини шару, у якому збуджується поверхневий плазмонний резонанс так І від оптичних параметрів і товщини шару, що контактує з шаром - носієм плазмонних коливань Міряючи зміну резонансних умов виникнення плазмонного ефекту, тобто отслеживая зміну положення мінімуму плазмонного • резонансу в часу (фіг 4), ми можемо судити про процеси взаємодії', що відбуваються на металевій поверхні й оцінити їх кількісно Чутливий елемент перетворювача, що заявляється (фіг 2 - 2) був виконаний нами з викорис танням призми повного внутрішнього відбитка, має кут при основі 68°, на робочу поверхню якої наносили шар золота (45 нм ) Золота плівка піддавалася модифікації моношаровою органічною матрицею, що вибрано взаємодіє з цікавлячою речовиною (адсорбуя її) Через призму на металеву поверхню падає промінь (фіг 2 - 1) р-полярізованого лазерного світла (633 ям) Сканування зразків у необхідному діапазоні кутів здійснюється на обертовій платформі задопомогою крокового двигуна (фіг 2 - 3) Для приведення в контакт робочої сторони металевої плівки з рідкою пробою передбачена проточна кювету з герметизуючим шаром із силиконової гуми об'ємом 100 рл. Подача проби здійснюється перистальтичним насосом (фіг 2 - 4). Сигнал, відбитий від металевої поверхні фіксується фотодюдом (фіг 2-5) Аналіз кутового положен-" ня і форми резонансної кривої реєструється керуючою програмою (фіг 2-6), що дозволяє одержувати в реальному масштабі часу кінетичну криву або сенсорограмму (фіг 4), що відбиває процеси адсорбції речовини моношаровою органічною матрицею з досліджуваної рідкої проби Результати вимірів математично опрацьовуються по спеціально розробленому алгоритмі Для приклада, із широкої розмаїтості об'єктів, що можуть бути ідентифіковані методом, що заявляється, були обрані барбітурати Барбітурати є депресантами центральної нервової системи і використовуються в медицині як болезаспокійливі, снотворні і протисудорожні засоби. Проте існує і негативна сторона зловживання цими речовинами1 вони можуть бути використані в якості наркотичних засобів При хронічному використанні барбітуратів розвивається звикання і смерть може наступити як від понад дозування, так І від різкого припинення прийому Тому дуже важливим є можливість визначення рівня барбітуратів у мочі та плазмі крові Різноманітні типи • молекулярно-організованих систем розглянуті докладно в книзі' А Ulman. An introduction to ultrathm organic films' from Langmuir-Blodgett to self-assembly Academic Press, Boston, 1991 Теорія про формування плівки, що самоорганізується, із суміші двох органосіркових молекул із різноманітною, довжиною вуглецевоаодневого ланцюга соадсорбцією описана у Colin. D. Bain and George M. Whitesides Formation of monolayer by the coadsorption of thiols on gold: variation in the length of the alkyl chain. J Am. Chem. Soc 1989, v. 111. № 18. 7164 - 7175. Існують посилання (Gabriel P Lopez, Hans A Biobuyck, Ralph Harter, Amit Kumar, and Georg M Whitesides Fabrication and imaging of two-dimensional patterns of protein adsorbed >,n self-assembled monolayers by scanning electron microscopy J. Am Chem Soc. 1993, 115, 10774-10781, Kathleen T. Kinnear and Harold G. Monbouquette Direct electron transfer to Eschenchia coli fumarate reductase in setf-assembled alkanethiol monolayers on gold electrodes Langmuir 1993, 9, 2255-2257) на використання поверхонь, модифікованих гідрофобними алкантіолами з довгим ланцюгом або їхніми сумішами для закріплення біологічних об'єктів за рахунок електростатичних, гідрофобних і ковалентних взаємодій. Хемосорбція сполук, що містять сірку, із довжиною вуглевоводневого ланцюга більш 9 на благородних металах із (0,1-1,0) т М розчину методом 34994 занурення на 24-72 годин з наступним промиванням у чистому розчиннику і сушінням, у результаті котрої молекули закріплюються на підкладці з утворенням ХІМІЧНОГО звязку, формує ЩІЛЬНІ, механічно і термічно (до 150°С) стабільні моношарові покриття в області десятків сотень ангстрем Вибір розчинника визначається типом використовуваного рецепторного компонента з переважним використанням етилового спирту і води, оскільки вони недорогі, нетоксичні і легко піддаються очищен ню Така плівка цілком покриває металеву поверхню вуглевоводневими ланцюгами і термінальні функціональні групи визначають в остаточному підсумку властивості модифікованої поверхні Для якісного і кількісного визначення барбітурової кислоти у водяних розчинах золота поверхня чутливого елемента оптичного перетворювача, що заявляється модифікувалася в такий спосіб 1 Готували 1 т М розчин додекантюла HS(CH2biCH3 в етиловому спирті (а), готували 1 т М розчин мапонілтюмочевини C4H4O2N2S (тюбарбітурова кислота) у 50 % суміші води й етилового спирту (б), утворювали суміш розчинів (а) і (б) у співвідношенні 1 20 2 Хемосорбцію здійснювали шляхом занурення свіжевиготовлених золотих плівок в утворену суміш на 24 години при температурі 25±5°С 3 Ретельне промивання в чистому етанолі протягом ЗО хвилин при температурі 25±5°С 4 Сушіння в потоку чистого повітря Приготовлена в такий спосіб органічна моношарова матриця з високим ступенем селективності адсорбує молекули малонілмочевини C4H4O3N2 {барбітурова кислота) Матрицю призводили в контакт із водяним розчином барбітурової кислоти при різноманітних концентраціях у діапазоні 1 нг/мл - 1 мг/мол Для перевірки селективності чутливого елемента здійснювали контакт із водяним розчином аналога барбітурової кислоти барбіталом СаНігОзИг (веронал) Час інкубації досліджуваної проби з модифікованою поверхнею чутливого елемента -20 хвилин Типова кінетична крива залежності зміщення резонансного кута від концентрації барбітурової кислоти подана на фіг 4 (2-8) При цьому адсорбції вероналу взагалі не спостерігається фіг 4 (1) Проведений експеримент підтверджує можливість прямого якісного і КІЛЬКІСНОГО визначення речовини в досліджуваній рідкій пробі на твердоТІЛЬНІЙ металевій поверхні модифікованій органічною моношаровою матрицею, за допомогою пристрою, що фіксує резонанс поверхневих плазмонгв 4 5 0-і 4 0 0 3 5 0 Ад .2300-1 Ш 2 50 О 200 х 1 00 50 2000 0 К у т п а д і н н я ( с е к ) ФІГ. 1 4 0 0 00 34994 Фіг. 2 ) гт +Au ііішіїїішшішшіїїіішпиштппіііїї МЕТАЛ Фіг. З 34994 7 4 0 0 -j 7 20 07 00 08800 6 в 00 о. 64 00 х 52 0 0 х 2000 4000 Час 6000 8000 10000 12000 (сек) Фіг. 4 1000 800 600 400 2 00 t 1Е-101Е-9 1 Е -6 1 Ё -7 1 Е -в 1 Є - 5 1 Е - 4 1 Е - 3 0 , 0 1 К о н ц е н т р а ц і я (г/мл) X en Фіг. 5 Тираж 50 екз Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000 м Ужгород, вуп Гагаріна, 101 (03122)3-72-89 (03122)2-57-03