Спосіб визначення пара-нітрохлорбензолу та його метаболітів в одній пробі сечі

Способ определения пара-нитрохлорбензола її его метаболитов из одной пробы мочи, включающий экстракцию из эфиров, упаривание экстракта, хроматографирооание, раздельное количественное определение, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что перед экстракцией пробу насыщают хлоридом натрия, очистку от коэкстрактивных веществ проводят путем реэкстракции фенолов раствором едкого натра с последующим пере водом их в эфирный экстракт, после нанесения упаренного экстракта на пластины "Силуфол" производят злюирование фенолов и пара-нитрохлорбензола на пластине этанолом на расстояние 15-30 мм от линии старта, проводят двукратное хроматографирование методом тонкослойной хроматографии в различных системах с использованием подвижной фазы 1 бензол-хлороформ-этанол в соотношении 25:8:2 и подвижной фазы 2 бензол, после просушивания верхнюю часть пластины отрезают и обрабатывают раствором парадиметиламинобензальдегида для проявления пара-иптрохлорбензола с последующим элюнрованием этанолом и спектрофотометрированием, оставшуюся часть пластины обрабатывают раствором едкого натра для проявления фенолов с последующим элюированием каждого из них указанным раствором и спектрофотометрированием. Изобретение относится к аналитической химии, а именно к количественному определению токсических веществ и продуктов их метаболизма в биологических средах методом тонкослойной хроматографии, в частности к способу определения пара-нитрохлорбензола и его метаболитов в моче. Известен колориметрический способ определения пара-нитрофенола в моче путем экстракции пара-нитрофенола из гидролизованной мочи экстракционной смесью, содержащей 4 части петролейногоээфира и 1 часть диэтилового эфира с добавлением 1 % изоамилопого спирта, реэкстрагированием пара-нитрофенола раствором аммиака, восстановлением цинковой пылью с соляной кислотой, колориметрированием при длине волны 630 им (Гадаскина И.Д., Филов В.А. Превращение и определение промышленных ядов в организме, 1970, с. 248-249). Недостатком способа является его неспецифичность и непригодность для раздельного количественного определения С > 4 О О Ю 14609 пэра нитрохлорбензола и фенолов при одновременном их присутствии в моче. Известен колориметрический способ определения пара-аминофенола в моче путем отделения коэкстрактивных пигментных ве- 5 ществ экстракцией их бутанолом, проведением цветной реакции с tf-нафтолом в присутствии аммиака, экстракции окрашенного продукта реакции бутанолом, встряхиванием с едким натром и колориметрированием 10 бутанольной фазы с оранжевым светофильтром (Гадаскина И.Д., Филов В.А.. Превращение и определение промышленных ядов в организме, 1970, с. 274-275). Недостатки способа те же, что и в пер- 15 вом случае. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к изобретению является способ определения пара-нитрохлорбензола и его метаболитов в 20 моче путем экстракции веществ эфиром с последующим выделением каждого из них методом колоночном, а затем бумажной хроматографии (Bray H.I., James S.P. Thorp the metabolism of the monochlorobenzene In the 25 Rabbit. The biochemical Journal, 1956, V. 64, № 1, p. 38-44. Перевод выдержек из статьи, имеющих отношение к способу определения паранитрохлорбензола и его метаболитов, при- 30 лагается. Недостатками известного способа являются его невысокая чувствительность, большая трудоемкость и длительность проведения анализа по сравнению с тонко- 35 слойной хроматографией (только бумажная хроматография длится более 10 часов с применением большого числа токсичных растворителей и проявляющих реагентов). В основу изобретения поставлена зада- 40 ча разработки специфичного, точного, чувствительного, быстрого, простого и доступного в исполнении способа определения пара-нитрохлорбензола (ПНХБ), и его метаболитов - 2-амино-5-хлорфенола (2А5ХФ), 2-хлор- 45 5-нитрофенола (2Х5НФ), пара-нитрофенола (ПНФ), мета-нитрофенола (МНФ), пара-аминофенола (ПАФ), орто-аминофенола (ОАФ) при совместном их присутствии в одной пробе мочи путем экстракции их эфиром, хрома- 50 тографирования методом тонкослойной хроматографии и количественного определения спектрофотометрированием, обеспечивающего раздельное количественное определение ПНХБ, 2А5ХФ, 2Х5НФ, ПНФ, 55 МНФ, ПАФ, ОАФ из одной пробы мочи. Для решения поставленной задачи применяется высаливание (насыщение мочи хлоридом натрия), уменьшающее растворимость определяемых веществ в моче и уве личивающее степень извлечения их эфирной фазой. Высаливание улучшает также разделение фаз эфир/моча, обеспечивающее максимальный переход фенолов в эфирную фазу, что наглядно видно из таблицы 1. При экстракции определяемых веществ из биологических объектов (в частности, из мочи) одновременно извлекается большое количество коэкстрактивных органических веществ (жиры, пигменты), особенно много из гидролизованной мочи, которые мешают при последующем хроматографировании и идентификации веществ. Для удаления части коэкстрактивных веществ (остаются в эфирной фазе) проводят реэкстракцию фенолов из эфирного экстракта двумя порциями 1N едкого натра с последующем переводом их при рН 7,0 в эфирную фазу. После упаривания экстракта и нанесения его на пластину "Силуфол" проводят элюирование фенолов и ПНХБ этиловым спиртом на расстояние 15-30 мм от линии старта, что обеспечивает концентрирование веществ в узкой полосе (2 мм) и в дальнейшем способствует более четкому разделению их при последующем хроматографировании. В случае расстояния меньше 15 мм фенолы плохо отделяются от коэкстрактивных веществ, остающихся на линии старта, а увеличение расстояния более 30 мм нецелесообразно, поскольку уменьшение пути пробега растворителей от линии старта до линии финиша ухудшает хроматографическое разделение веществ. Применение хроматографирования в двух системах растворителей 1) бензол-хлороформ-этанол в соотношении 25:8:2 и 2) бензол обеспечивает более четкое разделение определяемых веществ с оптимальными значениями Rf (Rf — величина, характеризующая положение пятна на хроматограмме): 0,93 - для ПНХБ; 0,75 - для 2Х5НФ; 0,65 для МНФ; 0,54 -для ПНФ; 0,39 - для 2А5ХФ; 0,31 - для ОАФ; 0,12 - для ПАФ. Общее время, затрачиваемое на хроматографирование - не более часа. Дальнейшее количественное определение всех веществ осуществляется следующим образом: отрезав верхнюю часть пластины (20-30 мм ниже линии фронта), опрыскивают ее 1 % раствором пара-диметиламинобензальдегида (ПДМАБА) для проявления ПНХБ и слегка подогревают для более быстрого удаления растворителя. Большие количества ПНХБ видны в УФ-свете в виде темных пятен и без проявления. Проявившиеся светложелтые пятна счищают в пробирку, элюируют этанолом и после центрифугирования спектрофотометрируют при длине волны 270 им. 14609 Аналогично определяют и фенолы, опрыскивая оставшуюся часть пластины 1N раствором едкого натра, высушивают ее, слегка подогрев, счищают пятна, соответствующие каждому из определяемых фенолов в пробирки, 5 элюируют тем же раствором едкого натра и спектрофотометрируют при длине волны 230 им. Способ осуществляется следующим образом. 30 мл человеческой или 5-10 мл.крыси- 10 ной мочи профильтровывают через бумажный фильтр в пробирки с притертыми пробками емкостью 50-100 мл. Проверяют рН мочи (стандартные условия - 6,0-7,0), после чего растворы насыщают хлоридом 15 натрия. В каждую пробирку приливают по 8 мл эфира и встряхивают не очень интенсивно во избежание образования эмульсии в течение 15 мин. После того, как пробы отстоятся ( ~ 5 мин), отбирают эфирный слой в 20 химические пробирки. Проводят повторное экстрагирование 5 мл эфира. Экстракты объединяют и упаривают при отсутствии открытого огня при температуре 40-50°С под вытяжкой до 0,2-0,3 мл. Эфирный экстракт 25 содержит свободные фенолы и ПНХБ. Проводят гидролиз мочи с целью высвобождения фенолов, присутствующих в моче в связанном состоянии. Для этого пробирки с мочой помещают в кипящую водяную ба- 30 ню, удаляют остатки эфира и приливают концентрированную соляную кислоту в количестве 1 /4 от объема взятой для анализа мочи. Пробирки закрывают пробками и кипятят в течение 40-50 мин. После охлаж- 35 дения рН раствора доводят до 7,0 насыщенным, а затем 1N раствором едкого натра, растворы охлаждают и профильтровывают . через бумажные фильтры в другие пробирки емкостью 50 мл и проводят две экстракции 40 эфиром: первую 8 мл, вторую 5 мл. Эфирные экстракты собирают в пробирки емкостью 50 мл и проводят реэкстракцию фенолов 1N раствором едкого натра порциями по 5 и 3 мл, встряхивание по 5 мин. После того, как 45 растворы отстоятся (~ 5 мин), отбирают нижний щелочной слой в пробирки емкостью 50 мл, доводят рН до 6,0-7,0 соляной кислотой, охлаждают, насыщают растворы хлоридом натрия и проводят две экстракции эфиром 50 порциями по 5 и 3 мл аналогично описанному выше. Экстракты объединяют и упаривают. Экстракт содержит определяемые фенолы, находящиеся изначально в связанном состоянии. 55 Подготовленные экстракты наносят на пластину "Силуфол" на расстоянии 15-20 мм от нижнего края и высушивают на воздухе под вытяжкой. В хроматографическую камеру N1 вносят подвижную фазу N1: бензол 6 хлороформ-этанол в соотношении 25:8:2, во вторую камеру вносят подвижную фазу N2: бензол и выдерживают растворители в камерах до разгонки пластин минимум 30 мин. В третью камеру вносят этанол (слой 3-5 мм), куда и помещают пластины перед хроматографированием, элюируя вещества на пластине на расстояние 15-30 мм от линии старта. После удаления этанола пластины помещают в подвижную фазу N1, время хроматографирования 25-30 мин, высушивают на воздухе и помещают в подвижную фазу N2, время хроматографирования 15-20 мин, после чего пластину просушивают на воздухе до полного удаления растворителя. Верхнюю часть пластины (20-30 мм ниже линии фронта) отрезают и обрабатывают с целью проявления ПНХБ 1% раствором парадиметиламинобензальдегида (ПДМАБА), который готовят следующим образом: 2,4 г ПДМАБА растворяют в 30 мл этанола, прибавляют 30 мл конц. соляной кислоты и 180 мл н-бутанола, выдерживают 2 недели в темном месте. Пластину нагревают и просушивают. На пластине появляются светложелтые пятна. Если пятна недостаточно яркие, операцию следует повторить. Остальную часть пластины обрызгивают 1N раствором едкого натра для проявления фенолов и высушивают. Для более быстрого проявления пятен пластину подогревают. Для количественного определения ПНХБ окрашенные пятна счищают в центрифужные пробирки и приливают по 3,5 мл этилового спирта. Растворы перемешивают в течение 2 мин, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин и спектрофотометрируют при длине волны 270 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм против контроля, которым служит часть пластины, не содержащая определяемое вещество. Количественное определение фенолов проводят аналогично ПНХБ, счищая окрашенные пятна, соответствующие каждому из определяемых фенолов, в центрифужные пробирки, добавляют по 3,5 мм 1N раствора едкого натра, перемешивают в течение 10 мин центрифугируют и снимают оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 230 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм против контроля, которым служит силикагель, счищенный с участка пластины, не содержащего определяемые соединения. Количество ПНХБ, 2А5ХФ, 2Х5НФ, ПНФ, МНФ, ПАФ, ОАФ в пробе находят по соответствующим калибровочным графикам, отражающим зависимость оптической плотности растворов от количества исследуемых веществ. Для построения калибровочного графика готовят стандартные растворы 14609 8 каждого из веществ с содержанием 50, 100, 200. 400, 500 мкг/мл. На хроматографическую пластину наносят по 0,1 мл каждого из растворов, что соответствует 5, 10, 20.40, 50 мкг вещества. Шкалу стандартов обрабатывают аналогично пробам. Содержание ПНХБ, 2А5ХФ, 2Х5НФ, ПНФ, МНФ, ПАФ, ОАФ (мкг/мл) С вычисляют по формуле фенолов - 2 мкг. Длительность проведения анализа - около 4-5 ч. В таблице представлен процент опреде ления ПНХБ, 2А5ХФ, 2Х5НФ, ПНФ, МНФ, ПАФ, МНФ, ОАФ при добавлении их к исследуемому объекту (в мочу) в количестве 20 мкг с высаливанием и без него. Предлагаемый способ обеспечивает раздельное количественное определение 10 ПНХБ и его метаболитов - 2А5ХФ, 2Х5НФ, Q ПНФ, МНФ, ПАФ, ОАФ при совместном их присутствии в одной пробе мочи и может быть рекомендован для использования в качестве теста экспозиции на производстве где Q - количество определяемого компо15 нитрохлорбензолов с целью оптимизации нента по всей пробе, мкг; санитарного контроля и предупреждения V - количество исследуемой мочи, мл. токсического воздействия нитрохлорбензоЧувствительность определения ПНХБ лов в условиях производства. предлагаемым способом составляет 5 мкг, Процент определения • ПНХБ 2А5ХФ 2Х5НФ ПНФ МНФ ПАФ ОАФ С высаливанием 92 92 80 91 86 86 90 Без высаливания 78 73 58 64 66 68 76 Упорядник Замовлення 4139 Техред М.Моргентал Коректор М. Керецман Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, КиТв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.ГагарІна, 101