Спосіб визначення патоімунного компоненту дегенеративного процесу в системі сполучної тканини

Спосіб визначення патоімунного компоненту дегенеративного процесу в системі сполучної тканини, шляхом виявлення сироваткових протисполучнотканинних аутоантитіл у параспецифічних імунодіагностичних реакціях in vitro з ксеногенним біоорганічним субстратом, який відрізняється тим, що сироваткові аутоантитіла визначають за рівнем цитотоксичної дії на клітини імунокомпетентної системи в реакції лейкоцитолізу, яку ІНІЦІЮЮТЬ інкубацією ізольованих лейкоцитів в присутності біогенного препарату алфлутопу і досліджують у полі зору люмінесцентного мікроскопа, а результат оцінюють на основі порівняння реакцій у контрольному і дослідному препаратах Винахід стосується медицини, зокрема клінічної імунологи і біофізики, і може бути використаний для лабораторної імунодіагностики патологічних процесів в організмі на рівні клітинно-гуморальних реакцій імунокомпететної системи для уточнення діагнозу, оцінки ефективності лікування і профілактики захворювань з патогенетично вагомим імунопатолопчним компонентом Відомий спосіб визначення патоімунного компоненту дегенеративного процесу в системі сполучної тканини шляхом виявлення сироваткових протисполучнотканинних аутоантитіл у параспецифічних імунодіагностичних реакціях in vitro з ксеногенним біоорганічним субстратом [1] За відомим способом визначають сироваткові антитіла до біогенного стандартизованого препарату, наприклад, румалому, шляхом осадження комплексу антиген-антитіло в присутності солей кадмію з наступною КІЛЬКІСНОЮ оцінкою утвореного преципітату турбідиметричним методом, а за показником вмісту сироваткових протирумалонових антитіл роблять висновок про інтенсивність імунопатолопчного - автоімунного деструктивного процесу в системі сполучної тканини ших етапів діагностичного дослідження До недоліків відомого способу слід віднести також недостатній рівень клініко-лабораторної інформативності, оскільки ВІДОМОСТІ про рівень оптичної густини, а отже концентрацію антитіл до елементів сполучної тканини у параспецифічній тестовій пробі є недостатньо інформативними При розгляді технічного завдання була взята до уваги здатність лейкоцитів як клітин імунокомпететної системи, що несуть генетичну інформацію про антигенну структуру тканин власного організму, ВІДПОВІДНИМ чином реагувати як на змінену патологічним процесом власну сполучну тканину, так і на молекулярні компоненти гетерогенної тканини, зокрема, у вигляді біоорганічного субстрату біогенного препарату, наприклад, алфлутопу [2] Попередніми дослідженнями було встановляю, що в присутності сироваткових протисполучнотканинних аутоантитіл алфлутоп індукує in vitro цитодеструкцію лейкоцитів у вигляді реакції лейкоцитолізу, яку з високою інформативністю дораджують методом люмінесцентної мікроскопи Недоліком відомого способу є недостатній рівень методичного забезпечення, який полягає у необхідності виконання складної методики отримання, суспензії лімфоцитів шляхом центрифугування венозної крові в градієнті густини фіколвірографін 1,077г/см3, наступним одномоментним відмиванням і ресуспендуванням у ізотонічному розчині натрію хлориду для проведення подаль В основу винаходу поставлене завдання вдосконалити відомий спосіб, в якому шляхом введення в діагностичну імунну реакцію більш чутливого й організованого в структурно-біологічному аспекті імунологічного тест-об'єкту досягають підвищення технологічності та клініко-лабораторної інформативності діагностичного дослідження Поставлене завдання вирішують тим, що у відомому способі визначення патоімунного компоненту дегенеративного процесу в системі сполуч ю ^00 Ю Ю 55845 ноі тканини шляхом виявлення сироваткових протисполучнотканинних аутоантитіл у параспецифічних імунодіагностичних реакціях in vitro з ксеногенним біоорганічним субстратом ВІДПОВІДНО ДО винаходу сироваткові аутоантитіла визначають за рівнем цитотоксичної дії на клітини імунокомпетентної системи в реакції лейкоцитолізу, яку ІНІЦІЮЮТЬ інкубацією ізольованих лейкоцитів в присутності біогенного препарату алфлутопу і досліджують у полі зору люмінесцентного мікроскопу, а результат оцінюють на основі порівняння реакцій у контрольному і дослідному препаратах Спосіб здійснюють таким чином У стерильну мікропробірку набирають 0,20,4мл крові, стабілізованої 2% розчином натрію цитрату у співвідношенні 4 1 Після 45 хвилинної спонтанної седиментації лейкоцитів мірною піпеткою набирають завис лейкоцитів в аутолопчній плазмі крові в об'ємі 20-40мкл, наносять по одній пробі на два краї предметною скла (контроль і дослід) і до однієї з них - дослідної - вносять рівний об'єм препарату алфлутопа і шкубують впродовж 45-бОхв при 37°С в умовах вологої камери, наприклад, у чашці Петрі, після чого в обидва мікропрепарати - контрольний і дослідний - вносять по 20мкл розчину флюорохрому АО в розведенні 1 10000 (рН 6,5), накривають скельцями, ще витримують впродовж ЗОхв при 37°С, після чого досліджують у полі зору люмінесцентного мікроскопу, реєструють яскравість люмінесценції, визначають характер цитолізу та процентний вміст у мікропрепараті пошкоджених клітин Висновок про рівень імунодеструктивних процесів в аутолопчній сполучній тканині роблять на основі порівняння результатів реакції лейкоцитолізу в контрольному і дослідному мікропрепаратах Приклад 1 Хлопчик П, 13 років, перебував на стаціонарному лікуванні з приводу остеохондропатм хребта (хвороба Шойерман-Мау) Ожиріння ІІ-ІІІ ст Хронічний холецисто-холанпт, в'ялий перебій фаза загострення Гіперплазія щитовидної залози 1 ст, Дизметаболічна нефропатія, Остеопенічний синдром В зв'язку з недостатньою інформативністю показників периферичної крові і необхідністю встановити рівень збурення патоімунного компоненту дегенеративного процесу в системі сполучної тканини у хворого провели дослідження крові на вміст сироваткових протисполучнотканинних аутоантитіл за запропонованим способом у параспецифічній імунодіагностичній реакції in vitro з препаратом біогенним препаратом алфлутопом Для цього у стерильну мікропробірку внесли 0,4мл крові, стабілізованої 2% розчином натрію цитрату у співвідношенні 4 1 і витримували при кімнатній температурі впродовж 45хв для спонтанної седиментації лейкоцитів За допомогою мікропіпетки по 20мкл завису лейкоцитів в аутоплазмі нанесли на два краї предметного скла (контроль і дослід), після чого до дослідної проби внесли рівний 20мкл препарату алфлутопа, залишаючи інтактною контрольну пробу М ікро препарат шкубували впродовж бОхв при 37°С в умовах вологої камери в чашці Петрі, після чого до контрольної і дослідної проб внесли по 20мкл розчину флюорохрому АО в розведенні 1 10000 (рН 6,5), накрили скельцями і після ЗО хвилинної витримки в термостаті при 37°С досліджували у полі зору люмінесцентного мікроскопу з реєстрацією характеру люмінесценції, реакції цитолізу і процентного вмісту пошкоджених клітин Рівень імунодеструктивних процесів в сполучній тканини визначали шляхом порівняння результатів реакції лейкоцитолізу в контрольному і дослідному мікропрепаратах Приклад 2 Запропонованим способом проведена оцінка рівня і значущості деструктивного компоненту в формуванні патологічного ураження органів о пор но-рухового апарату у 138 хворих з дегенеративними процесами в тканинах опорнорухової системи, шляхом співставлення отриманих результатів з показниками вмісту антитіл проти алфлутопу у 32 здорових дітей аналогічного віку (табл) Таблиця Показник Індекс патоімунної деструкції сполучної тканини за рівнем реакції лейкоцитолізу, у о Здорові діти п-32 Хворі на остеохондропатію п=138 абс % абс % 1,03+0,01 100 1,94+0,03 188 Наведені у таблиці дані вказують на те, що зростанню рівня патоімунних дегенеративних процесів у сполучній тканині у хворих дітей відповідає посилення ініційованого алфлутопом лейкоцитолітичного компоненту в тестових пробах, що знайшло відображення у збільшенні діагностичного індексу патоімунної деструкції сполучної тканини Так, у хворих дітей з остеохондропатіями значення індексу, порівняно із здоровими дітьми, зросло на 88% Таким чином, запропонований спосіб забезпечує більш високий, ніж за способом-прототипом, рівень клініко-діагностичної інформативності об стеження хворих з хронічним деструктивним патоіммуним процесом сполучнотканинних компонентів і може бути застосований в широкій медичній практиці Джерела інформації, які слід взяти до уваги 1 Бененсон Е В , Мамасаидов А Т , Цай Е Г Антигеноспецифическая В-клеточная активация при ревматоидном артрите и остеоартрозе// Ревматология-1992-№1 -С 18-22 2 Алфлутоп Антиревматическое средство с противогиалуронидазным действием КО Биотехнос АО, Бухарест-Румыния Инструкция к применению 55845 Підписано до друку 05 05 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24