Спосіб визначення ентеротоксинів escherichia coli клітинним біосенсором на основі інфузорій stylonychia mytilus

Спосіб біосенсорного визначення ентеротоксинів Escherichia coli, що включає приготування суміші розчину з ентеротоксинами і інфузоріями, інкубацію, забарвлення трипановим синім, який відрізняється тим, що використовують біотрансд'юсер на основі інфузорій Stylonichia mytilus, який розпізнає та перетворює інформацію про кількість інфузорій в сигнал, що фіксується фізичним трансд'юсером, який здійснює підрахунок загиблих під впливом ентеротоксинів інфузорій, а також оцінку ступеня токсичності в автоматичному режимі. (19) (21) u201009869 (22) 09.08.2010 (24) 25.02.2011 (46) 25.02.2011, Бюл.№ 4, 2011 р. (72) СУХАРЄВ ЮРІЙ СТАНІСЛАВОВИЧ, СУХАРЄВ СТАНІСЛАВ ЮРІЙОВИЧ, ГОЛОВІНА ІРИНА ВОЛОДИМИРІВНА (73) СУХАРЄВ ЮРІЙ СТАНІСЛАВОВИЧ, СУХАРЄВ СТАНІСЛАВ ЮРІЙОВИЧ, ГОЛОВІНА ІРИНА ВОЛОДИМИРІВНА 3 ал, який культивується, легко відтворюється і підтримується у чистій культурі; автоматизація обліку і аналізу одержаних даних, що виключає фактор суб'єктивності при візуальній оцінки результатів досліджень; специфічність - здатність аналізувати складні суміші на присутність ентеротоксинів Е.соlі без передчасної їх очистки; можливість відносного визначення кількості і строків максимального накопичення ентеротоксинів у середовищі культивування, чутливість, здатність до виявлення низьких концентрацій ентеротоксинів у малих зразках; швидка відповідь; безпека при використанні; точність результатів; доступність для масового виробництва, а також можливість здійснювати оцінку токсичності природних вод, промислових викидів, кормів і внутрішнього середовища організму людини і тварин, що відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином. В ячейки 96 луночного полістіролового планшета вносять по три краплі тест-організмів, при цьому в лунку попадає приблизно 50 інфузорій Stylonichia mytilus; для тестування однієї проби використовують дві повторності, при цьому 2 лунки залишаються контрольними; в якості контролю використовують стерильне середовище ЛозінаЛозинского з 0,5-1,0% розчином тріпанового синього, в якому інфузорії залишаються живими. Досліджуваний водний розчин тестуємих речовин вносять піпеткою в лунки планшета в кількості 4 крапель, не торкаючись поверхні середовища з внесеними раніше інфузоріями, після чого додають 0,5-1,0% розчин тріпанового синього. Через 60хв. після внесення проби, результат токсикологічного анализу фіксують цифровою фотокамерою, встановленою на мікроскоп, і переносять на екран монітора, де за допомогою програми "Totallab" здійснюють підрахунок чисельності загиблих (забарвлених) інфузорій. Приклад 1. Добові культури токсигенних штамів Е.соlі центрифугували на рефрижераторній центрифузі при 5000g на протязі 30хв., відокремлювали бакмасу і одержували безклітинний супернатант, який містив нативні ентеротоксини. Визначення білка ентеротоксинів проводили спектрофотометрично за методом Варбурга і Христиана при 260 і 280нм. Концентрацію білка розраховували по формулі Калькара: мг/мл = 1,45Е2800,74Е260. У якості контроля використовували штам Е.соlі М-17, представляючий собою пробіотичний препарат "Колібактерин" ("Ромакол"). Для визначення специфичності біотрансд'юсера - стерильне живільне середовище Хоттінгера, а також культуральний безклітинний фільтрат Proteus vulgaris. Культивування інфузорій проводили в закрытих чашках Петрі у середовищі Лозіна-Лозинского, яке готували на дистильованій воді з додаванням наступних солей (г/л): NaCl - 0,1; КСl - 0,01; NaHCO3 - 0,02; MgSO4 - 0,01; СаСl2 - 0,01, підтримуючи оптимальну температуру 24-26°С. Досліджуваний водний розчин тестуємих речовин вносили піпеткою в лунки планшета в кількості 4 крапель, не чіпаючи поверхні середовища з 57414 4 внесеними раніше інфузоріями, після чого додавали 1% розчин тріпанового синього. Оптична підсистема забезпечувала надійну видимість об'єкту розміром 200-250мкм (інфузорії Stylonichia mytilus) і захват у поле зору фотокамери всієї лунки мікропанелі діаметром 14мм і глибиною 6мм. Електронна підсистема забезпечувала: зручну настройку системи; визначення ступеня токсичності одного або декількох зразків у заданому числі лунок; введення і редактування необхідної додаткової інформації; запис одержаних результатів на диск і читання їх з диска; розпечатку одержаних результатів на принтері. Через 60хв. після внесення проби, результат токсикологічного анализу фіксували цифровою фотокамерою і переносили зображення на екран монітора, де за допомогою програми "Totallab" здійснювали підрахунок чисельності загиблих інфузорій. Фіксували тільки забарвлені особини. Чисельність інфузорій через 60хв. експозиції у % від числа посажених розраховували по формулі: N N2 100 %, N1 де: N1 - загальна чисельність посажених інфузорій; N2 - загальна чисельність інфузорій через 60хв. експозиції. Ступень токсичності культуральних безклітинних супернатантів штамів E.coli, визначали за допомогою біотрансд’юсера, по кількості загиблих інфузорій Stylonichia mytilus, відповідно зі шкалою, вказаною в табл. 1. Для одержання достовірних даних дослід багаторазово повторювали, потім підраховували середній показник. Чим вище відсоток лізованих (загиблих) інфузорій, тим більш токсичним є культуральний супернатант, а досліджуваний штам E.coli відповідно - токсигенним (табл. 2). Приклад 2. Вимоги до умов аналізу і параметрам програми: - температура в лункі в момент вимірювання повинна підтримуватися на рівні 24-26°С; - час експозиції інфузорій в лунці після їх пересадки з чашки Петрі перед першим підрахунком складає не менше 15хв. і залежить від встановлення оптимальної температури і чистоти лунки. - для роботи використовували тільки добову культуру інфузорій. Культура більш старшого віку (2-3 добова) характеризується нестабільною реакцією на токсичні речовини і більш високою стійкістю до них; - для створення оптимальних оптичних умов слід забезпечити вибір такого об'єму розчину, щоб його рівень у лунці не перевищував 4мм, що досягалося при внесенні у лунку 6-7 крапель розчину; - оптимальна щільність інфузорій - в межах 5070 клітин у лунці; - особливо суворі вимоги предъявляли до чистоти лунки, критерієм якої є відсутність в контролі подавления активності інфузорій через 60хв. після першого підрахунку (перший підрахунок проводили через 20-30хв. після посадки інфузорій у лунку). 5 57414 Приклад 3. Визначення відносної кількості і строків максимального накопичення LT- і ST-ентеротоксинів E.coli. Токсигенні штами кишкової палички культивували в Синтетичному живильному середовищі [Сухарев Ю.С., 1992] при 37°С, і через 18, 20 і 24 години здійснювали контроль токсичності, визначаючи кількість загиблих Stylonichia mytilus у середовищі культивування. У якості контроля викорис 6 товували не токсигенний штам, який вирощували в таких самих умовах, стерильне середовище культивування токсигенних штамів і культуральний безклітінний супернатант P.vulgaris. Максимальне накопичення токсинів реєстрували через 24 години культивування штаммів, слідством чого був більш високий відсоток загибелі інфузорій в супернатантах культур E.coli (табл. 3). Таблиця 1. Ступень токсичності культуральних безклітинних супернатантів ентеротоксигенних штамів Е.соlі, визначаєма по кількості загиблих інфузорій Stylonichia mytilus. Ступень токсичності Нетоксичний Слаботоксичний Токсичний Загибло інфузорій (%) 0-19 20-50 51-100 Таблиця 2. Кількість загиблих Stylonichia mytilus в безклітинних супернатантах штамів Е.соlі, які вирощували у живильному середовищі Хоттінгера (24 год., 37°С). В контролі використовували стерильне середовище Хоттінгера ікультуральний безклітинний супернатант P.vulgaris. Досліджуваний зразок Супернатант Е.соlі O9ST+ Супернатант Е.соlі O26LT+ Супернатант Е.соlі М17 Супернатант P.vulgaris Стерильне середовище Хоттінгера Експозиція (хвилин) 60 60 60 60 60 Загиблих Stylonichia mytilus (%) X±s, n=4 97,5±2,5 98,0±1,5 2,5±0,2 2,0±0,2 2,0±0,2 Таблиця 3. Відносна кількість і сроки максимального накопичення LT- и ST-ентеротоксинів Е.соlі, визначені за допомогою клітинного біосенсора на основі інфузорій Stylonichia mytilus. Досліджуваний зразок Супернатант Е.соlі O9ST+ Супернатант Е.соlі O26LT+ Супернатант Е.соlі М\7 Супернатант P.vulgaris Стерильне середовище Хоттінгера Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко Час культивування штамів (год) 18 20 24 18 20 24 18 20 24 Підписне Загиблих Stylonichia mytilus (%) X±s, n=4 55,0±2,3 60,0±2,5 97,5±2,5 59,5±1,5 63,5±1,5 98,0±1,5 2,0±0,2 2,5±0,2 2,5±0,2 2,0±0,2 2,0±0,2 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601