Спосіб біосенсорного визначення ентеротоксинів e.coli

Спосіб біосенсорного визначення ентеротоксинів Е.соlі, що включає приготування суміші розчину з ентеротоксинами і плазмою крові, інкубацію, додавання розчину АДФ, який відрізняється тим, що використовують біотрансд'юсер на основі тромбоцитів крові, який під дією ентеротоксинів Е.соlі розпізнає та перетворює інформацію про зміни агрегаційної активності тромбоцитів в сигнал, що фіксується фізичним трансд'юсером за допомогою фотометричного агрегометра. (19) (21) u201009267 (22) 23.07.2010 (24) 25.01.2011 (46) 25.01.2011, Бюл.№ 2, 2011 р. (72) СУХАРЄВ ЮРІЙ СТАНІСЛАВОВИЧ, СУХАРЄВ СТАНІСЛАВ ЮРІЙОВИЧ, ГОЛОВІНА ІРИНА ВОЛОДИМИРІВНА (73) СУХАРЄВ ЮРІЙ СТАНІСЛАВОВИЧ, СУХАРЄВ СТАНІСЛАВ ЮРІЙОВИЧ, ГОЛОВІНА ІРИНА ВОЛОДИМИРІВНА 3 ротоксинів Е.соlі, що включає приготування суміші розчину з ентеротоксинами і плазмою крові, інкубацію, додавання розчину АДФ шляхом вилучення попередньої очистки ентротоксинів, використання біотрансд'юсера на основі тромбоцитів крові, який під дією ентеротоксинів Е.соlі розпізнає та перетворює інформацію про зміни агрегаційної активності тромбоцитів у сигнал, що фіксується фізичним трансд'юсером за допомогою фотометричного агрегометру. Використання способу біосенсорного визначення дає змогу аналізувати складні суміші на присутність ентеротоксинів без попередньої їх очистки; виявляти дуже низькі концентрації ентеротоксинів у малих зразках; здійснювати експресдіагностику колібактеріозу, визначати ентеротоксини Е.соlі ще до клінічної прояви хвороби, що дозволяє своєчасно проводити протиепідеміологічні і профілактичні заходи, а також здійснювати епізоотологічний моніторинг за присутністю і розповсюдженням токсигенних штамів кишкової палички у навколишньому середовищі, що відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином. Кров для постановки реакції беруть у пробірку з антикоугулянтом у співвідношенні 1:9, і відстоюють протягом 60 хв. за температури 4°С, після чого відокремлюють плазму, яка містить 270500×103/мл тромбоцитів, у стерильну пробірку. До 1 мл освітленої плазми додають 0,1-0,3 мл 3×106 М розчину АДФ, який є індуктором агрегації тромбоцитів, в концентрації 20-30 мкг/мл, потім додають розчин термолабільного, або (і) термостабільного ентеротоксинів Е.соlі, та інкубують 2040 хв., періодично перемішуючи, витримують за кімнатної температури протягом 10-30 хв., після чого пробу переносять в агрегометр, який виступає в ролі фізичного трансд'юсеру (перетворювача).На самописці отримують графічні зображення реакції тромбоцитів, що є біологічним трансд'юсером (перетворювачем). Постановці реакції передували два контроля. Негативний контроль: до 1 мл плазми крові додають 0,1-0,3 мл антикоугулянта (14 % розчин сульфату магнія; 3,2 % розчин дегідроцитрату натрію або 5000 Од/мл гепарину) і 0,1-0,3 мл 0,85 % NaCl. Позитивний контроль: до 1 мл плазми крові додають 0,1-0,3 мл антикоугулянта і 0,1-0,3 мл розчину АДФ. Кількість вільних тромбоцитів у позитивному контролі приймають за 100%. Дезагрегація тромбоцитів при негативному контролі є достовірним показником наявності у досліджуваному матеріалі ентеротоксинів Е.соlі. Приклад 1 Штами Escherichia coli O26 (LT+) и O9 (ST+) які продукують термолабільний і термостабільний ентеротоксини, окремо дворазово пасажували у 56837 4 бульоні Хоттінгера, потім висівали в 500 мл флакони з разрахунку 2 мл культури на 100 мл середовища. Кількість середовища складала 1/2 об'єму ємності. Інкубували протягом 20-24 годин в умовах аерації та перемішування за температури 37°С. Добові культури токсигенних штамів Е.соlі центрифугували на рефрижераторній центрифузі при 5000 g протягом 30 хв., відокремлювали бакмасу і одержували бесклітинний супернатант, що містив нативні ентеротоксини, які аналізували без попередньої очистки. Визначення білка ентеротоксинів проводили спектрофотометрично за методом Варбурга і Христиана при 260 и 280 нм. Концентрацію білка розраховували за формулою Калькара: мг/мл=1,45Е280-0,74Е260. До 1 мл освітленої плазми додавали 0,2 мл 3×106 М розчину АДФ, який є індуктором агрегації тромбоцитів, у концентрації 25 мкг/мл, витримували за кімнатної температури протягом 20 хв., потім додавали 0,5 мл розчину термолабільного, або (і) термостабільного ентеротоксинів Е.соlі, з вмістом білка в препаратах 10-20 мкг/мл. Більш високі концентрації зменшували, дезагрегуючи властивості ентеротоксинів, і інкубували 30 хв., періодично перемішуючи. Після чого реєстрували дезагрегацію тромбоцитів фотометричним методом у агрегометрі з графічним записом на самописці (мал. 2). Негативний контроль: до 1 мл плазми крові додавали 0,2 мл 14 % розчину MgSO4 і 0,2 мл0,85 % NaCl, (мал. 3). Позитивний контроль: до 1 мл плазми крові додавали 0,2 мл 14 % розчину MgSO4 і 0,2 мл розчину АДФ, (мал. 4). Приклад 2 Визначення специфічності тромбоцитарного біосенсора. До 1 мл освітленої плазми додавали 0,2 мл 3×106 М розчину АДФ у концентрації 25 мкг/мл, витримували за кімнатної температури протягом 20 хв., потім додавали 0,5 мл розчину мікотоксину Fusarium graminearum у концентрації 10-20 мкг/мл та інкубували 30 хв., періодично перемішуючи, після чого реєстрували агрегацію тромбоцитів фотометричним методом у агрегометрі з графічним записом на самописці (мал. 5). Таким чином, спосіб біосенсорного визначення ентеротоксинів Е.соlі дає змогу аналізувати складні суміші на присутність ентеротоксинів без передчасної їх очистки; виявляти дуже низькі концентрації ентеротоксинів у малих зразках; можливість здійснювати експрес-діагностику колібактеріозу, визначати ентеротоксини Е.соlі ще до клінічної прояви хвороби, що дозволяє своєчасно проводити протиепідеміологічні і профілактичні заходи, а також здійснювати епізоотологічний моніторинг за присутністю і розповсюдженням токсигенних штамів кишкової палички у навколишньому середовищі. 5 56837 6 7 Комп’ютерна верстка А. Рябко 56837 8 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601