Середовище для гіпотермічного зберігання ізольованої печінки

Середовище для гіпотермічного зберігання ізольованої печінки, що включає слабо проникний у клітини вуглевод і мікродобавки солей, яке відрізняється тим, що вуглевод містить сахарозу в концентрації 250мм умовах віварію Роботу з тваринами проводили з використанням наркозу (тюпентал натрію, внутрішньочеревинно, 50мг/кг ваги) Печінку анестезованих тварин перфузували in situ охолодженим до 4°С фізіологічним розчином через портальну вену з використанням перистальтичного насосу зі швидкістю 2,53,0мл/хв/г ВІДТІК крові і перфузату здійснювався через нижню порожнисту вену, яку надсікали в момент початку перфузм Після відмивання печінки і наповнення м ВІДПОВІДНИМ розчином консервування в портальну вену вводили катетер (діаметр 1,4мм) і фіксували його лігатурою Потім печінку з катетером акуратно видаляли з тіла тварини і негайно переносили у скляні флакони, наповнені охолодженим розчином консервування Підготовлену описаним вище чином печінку щурів зберігали в умовах побутового холодильника при температурі 0-4°С протягом 60 хвилин і 24 годин В якості розчинів консервування використовували відомий розчин Маршал і сахарозосольове середовище (фосфорнокислий натрій 1,8г/л, фосфорнокислий калій 2,04г/л, калій хлористий 0,372г/л, магній сірчанокислий 0,45г/л, кальцій хлористий 0,71 г/л і сахароза 85г/л бідистільованої води, рН7,4), що заявляється Відомо, ЩО збереження метаболічних показників органа після переведення його у фізіологічні умови (37°С) є надійним прогностичним показником його життєздатності [2] Тому після ВІДПОВІДНОГО терміну холодового зберігання печінку підключали через катетер до системи рециркуляційної перфузм Перфузію здійснювали 130мл мінімального сольового розчину Кребс-Рінгер-бікарбонат (рН7,4) протягом бОхв при температурі 37°С Перед початком перфузм в розчин вводили ЮмМ О 00 (О ю 57680 бування брали аліквоти для визначення динаміки збільшення активності цитоплазматичних ферментів Стан плазматичних мембран клітин печінки є специфічним феноменом, який чутливо реагує на найменші впливи В результаті відбувається порушення їх селективної проникності, втрата розчинних ферментів і дезорганізація клітин в цілому Визначення збільшення концентрації цитоплазматичних ферментів у внутрішньоклітинному середовищі є одним із розповсюджених тестів оцінювання стану плазматичних мембран клітин Вивчена динаміка зміни рівня активності лактатдегідрогенази (ЛДГ), аланшамшотрансферази (АлАТ) і аспартатамшотрансферази (АсАТ) Дані представлені в табл 2 і З Як видно із представлених результатів (табл 2), протягом нормотермічної реперфузм у середовищі інкубації спостерігається поступове збільшення активності ЛДГ незалежно від складу консервуючих середовищ І якщо в контрольних пробах (бОхв зберігання) різниця в активності ферменту не є достовірною, то після добового зберіУ свіжовиділеній і ВІДМИТІЙ від крові печінці гання печінки в заявлюваному середовищі рівень вміст АТФ становить 2,5-4,0мкмоль Одержані нацитоплазматичних ферментів після реперфузм ми результати узгоджуються з цими показниками, значно нижчий, ніж у розчині Маршал що свідчить про високий рівень штактності клітин печінки у складі органа і про їх адекватну реакцію Аналогічні результати були одержані при дона умови короткочасного гіпотермічного зберігання слідженні рівня активності трансаміназ (табл 3) в (бОхв) у середовищах різного складу Рівень внутреперфузіиному середовищі Нормотермічна рерішньоклітинного АТФ у контрольних пробах після перфузія після 24-год зберігання печінки в досліреперфузм зразків мав тенденцію до зниження і не джуваних розчинах консервування призводить до залежав від складу середовищ консервування достовірного збільшення активності трансаміназ порівняно з контролем Слід відзначити, що рівень Одержані дані свідчать, що ізольована печінка АлАТ і АсАТ є значно нижчим у зразках, які зберіна етапі контролю характеризується збалансованігалися протягом бОхв в сахарозо-сольовому серестю енергетичного метаболізму і короткочасна довищі, ніж у розчині Маршал Ця закономірність холодова ішемія (бОхв) не є лімітуючим моментом зберігається також після добового зберігання печідля збереження енергетичного пула в умовах, нки наближених до фізіологічних Після 24-ГОДИННОГО гіпотермічного зберігання Таким чином, одержані результати свідчать, ізольованої печінки зафіксовано зниження рівня що заявлюване середовище, яке містить у своєму АТФ Однак при використанні сахарозо-сольового складі слабо проникну в клітини сахарозу, дозвосередовища рівень внутрішньоклітинного АТФ на ляє зберегти більш високий метаболічний статус 12% вище, ніж у розчині Маршал Наступна норізольованої печінки після добового гіпотермічного мотермічна реперфузія зразків виявила ще більшу зберігання органа при 4°С різницю в ефективності використовуваних середоПриклад 2 Для обґрунтування концентрації вищ Після зберігання печінки в заявлюваному сахарози в заявлюваному середовищі були просередовищі рівень аденіннуклеотиду був на 20% ведені експерименти щодо вивчення активності вищим, ніж у розчині Маршал/Достовірне зниженЛДГ в реперфузіиному середовищі після добового ня рівня АТФ після добового гіпотермічного зберізберігання ізольованої печінки в розчинах консергання печінки, незалежно від використовуваного вування, які містять різні концентрації сахарози середовища, можна пояснити, з одного боку, виРезультати представлені в табл 4 снаженням внутрішньоклітинних субстратів окисЯк показують представлені дані (табл 4), найлення, а з іншого - його витратою на підтримку менший вихід ЛДГ у позаклітинне середовище гомеостазу клітин при холодовій ішемії і під час спостерігається при використанні у складі консернаступної нормотермічної реперфузм печінки вуючого розчину ізотонічної концентрації сахарози, що свідчить про незначну зміну проникності мемПереведення печінки з умов холодової ішемії бран гепатоцитів в нормотермічний стан дозволяє виявити латентні пошкодження гепатоцитів у складі органа Для Таким чином, одержані результати свідчать, порівняння ефективності середовищ консервуванщо заявлюване середовище більшою мірою заня печінку після гіпотермічного зберігання піддабезпечує збереження функціональновали нормотермічній реперфузм сольовим розчиметаболічного статусу ізольованої печінки після ном Кребс-Рінгер-бікарбонат (рН7,4) протягом 24-годинного зберігання органа при 4°С бОхв Через 10, ЗО, 60 хвилин із середовища інку HEPES , 5мМ глюкози й насичували карбогеном (час газації Зхв) Швидкість при реперфузм була такою ж самою, як і при відмиванні печінки від крові При порівняльному вивченні ефективності консервуючого розчину Маршал і сахарозосольового середовища, що заявляється, після добового зберігання ізольованої печінки щурів, основна увага приділялась збереженню енергетичного стану клітин печінки, оскільки енергетичний статус є основою функціональної та структурної ПОВНОЦІННОСТІ будь-якої клітини і тканини Досліджувався внутрішньоклітинний вміст АТФ у фізіологічних умовах після холодової ішемії, що є надійним показником збереження функціональних властивостей ізольованого органа перед трансплантацією Дані, представлені в табл 1, свідчать, що після добового зберігання органа при 4°С і наступній нормотермічній реперфузм заявлюване середовище зберігає більш високе енергетичне забезпечення печінки, ніж розчин Маршал 57680 Таблиця 1 Вміст АТФ (мкмоль/г) в печінці після її зберігання при 4 С (п=7) Середовище зберігання Розчин Маршал Заявлюване середовище 3,48±0,20 100% 3,61±0,24 100% 2,66±0,42 76% 2,89±0,29 80% 1,59±0,15 46% 2,08±0,28* 58% 0,80±0,22 2 1 % 1,43±0,19*40% Умови зберігання та інкубації Контроль, 4°С, 60 хв Наступна реперфузія при 37°С, 60 хв Зберігання, 4°С, 24 год Наступна реперфузія при 37°С, бОхв зміни достовірні порівняно із середовищем Маршал Таблиця 2 Рівень активності ЛДГ (U/V) у середовищі нормотермічної реперфузії після зберігання ізольованої печінки в середовищах різного складу (п=6) Середовище Маршал Сах -сол Контрольно хв зберігання, 4°С Юхв ЗОхв 60 хв 4,9±0,7 11,9±1,6 19,8±2,1* 4,0±0,8 10,7±0,6 16,6±1,8* Юхв 11,0±2,3 6,5±0,9 24 години зберігання,4 °С ЗОхв 60 хв 16,3±2,8 33,2±2,7* 13,8±0,8 24,0±0,8** зміни достовірні порівняно з початком інкубації, ** зміни достовірні порівняно із середовищем Маршал Таблиця З Рівень активності трансаміназ (U/V) у середовищі нормотермічної реперфузії після зберігання ізольованої печінки в середовищах різного складу (п=6) Фермент АсАТ АлАТ Середовище Маршал Сах -Сол Маршал Сах -сол Контроль, бОхв зберігання, 4иС Юхв ЗОхв бОхв 1,5±0,3 2,7±0 3 4,5±0,8* 1,8±0,4 1,8±0,4 2,6±0,1** 0,8±0,1 2,5±0,8 3,8±0,8* 0,8±0,1 1,3±0,4 1,6±0,3** 24 годин зберігання, 4иС Юхв ЗОхв 50хв 1,9±0,4 3,8±0,4 6,2±0,5* 1,9±0,3 3,7±0,2 4,6±0,6** 4,3±0,8 6,8±1,5* 12,6±2,0 1,7±0,4 3,0±0,7 7,0±1,2** зміни достовірні порівняно з початком інкубації, * зміни достовірні порівняно із середовищем Маршал Таблиця 4 Рівень активності ЛДГ (U/V) у середовищі нормотермічної реперфузії після добового зберігання печінки в середовищах з різною концентрацією сахарози (п=6) Час реперфузії (хв) Концентрація сахарози (г/л ) 10,0 8,0±1,0 7,2±0,9 6,5±0,9 6,9±0,5 8,4±0,8 70 80 85 90 100 Джерела інформації 1 Wahlberg J , Eklund THillered comparison of energy metabolism in rat liver grafts during preservation in University of Wmconsm or EuroCollins solution//Transplant Proceed -1995 -27 P 721-722 Комп'ютерна верстка Н Лисенко 60,0 29,7±1,8 24,9±1,6 24,0±0,8 25,2±1,2 32,2±3,0 2 Marshal V С , Howden В О , Lablohski P Effect of storage temperature in rat, liver transplantation 4°C is optimal and gives successful 48-hour preservation// Transpl Proceed - 1994 V 26, N6 - P 3657-3658 Підписано до друку 05 07 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна