Розчин для гіпотермічного зберігання ізольованих гепатоцитів

Использование: биотехнология. Сущность изобретения; для повышения морфофункциональной сохранности гепатоцитов используют среду, которая содержит следующие компоненту, г/л, трис-НС1-буфера, рН 7,4: хлористый калий 0,300-0,400; хлористый магний 0,100-0.200; хлористый кальций О.ШО-0.200; фосфорнокислый калий 0,050-0,200; фосфорнокислый натрий 0,050-0,100, сахароза 70,00-100.0; альбумин 5,000-10,00. 3 табл. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам длительного хранения изолированных гепатоцитов в условиях гипотермии. Известно использование среды 199 для гипотеомического хранения гепэтоцмтов. Однако эта среда не обеспечивает высокой морфофункциональной сохранности гепатоцитов. Наиболее близкой к изобретению является среда для гипотермического хранения гепатоцитов, включающая на 1 л трис-НСібуфера: сахароза 0,125 М; хлористый натрий 0,075 М; хлористый кальций 1,2 М. Однако известная среда не обеспечивает высокой морфофункциомалы-юй сохранности гепатсцитов, что обуслоалено наличием Б ней №С1, неблагоприятно влияющего на клетки. Целью изобретения является повышение морфофункциональной сохранности гации печени пластинчатым пестиком при возвратно-поступальном движении его со скоростью оборота вала 3000 об/мин. Свежееыделенные клетки оценивали по степени интактности плазматической мембраны и метаболической активности по следующим тестам: окрашивание клеток 0,6%-ным раствором трипанового синего в условиях 10-15-минутной инкубации при комнатной температуре, скорость эндогенного дыхания, содержание АТФ, степень связанности ЛДГ. После этого клетки переводили в стерильные растворы среды, разлитой в бакпечатки 5-10 мл и содержащей следующие компоненты, мас.ч: хлористый калий 0,300-0,400; хлористый магний 0,1000,200; хлористый кальций 0.100-0,200; фосфорнокислый калий 0,050-0,100; фосфорнокислый натрий 0.050-0.100; сахароза 70.0-100.0; альбумин 5,0-10,0; трисНСЬбуфер - до 1000 мл. Концентрация клеток составляла (5-10) ' 10° кл/мл. Бакпечатки хранили в течение 3 сут в бытаво_м холодильнике. Тем ГЄП?ТОЦИТОВ. П р и м е р . Выделение гепатоцитов проводили неФерментатиаиым методом с использованием ЭДТА и щадящей дезагре 1756351 Формула изобретения пература раствора 4-5°С. Стерилизацию среды проводили с использованием микроСреда для гипотермическогс хранения пористых капроновых мембран. изолированных гепатоцитов включающая Результаты представлены в табл.1, Из табл.1 следует, что предлагаемая 5 хлористый натрий, хлористый кальций м среда обеспечивает более высокую морфосахарозу, о т л и ч а ю щ а я с я тем. что. с функциональную сохранность гепатоцитов. целью повышения морфофункциональной чем известная. Это подтверхсдэется тем, что сохранности, она дополнительно содеризолированные гепзтоциты в заявляемой жит хлористый калий, хлористый магний, среде хорошо переносят иормотермиче- 10 фосфорнокислый калий, фосфорнокислый скую инкубацию (табл.2). натрий, альбумин при следующих соотношениях, мас.%: хлористый калий 0,300Полученные результаты свидетельствуют о том, что предлагаемая среда позволяет 0,400; хлористый магний 0,100-0,200; сохранять структурно-метаболический стахлористый кальций 0.100-0,200; фосфорнотус гепатоцитов а процессе хранения их при 15 кислый калий 0.050-0.100; фосфорнокислый 4°С в течение 3 сут. которые являются макнатрий 0,050-0.100; сахароза 70,0-100.0; симальны сроком этой системы клеток. альбумин 5.00-10,0; вода - до 1000 мл. Таблица 1 Метаболические параметры изолированных гепатоцитов до и после 3 сут гмпотермического хранения (п=6) Свежевыделен Параметоы ные Жизнеспособность, % ; Внеклеточное содержание ЛДГ, % Скорость эндогенного дыхания. нМОг/мин-млн клеток Содержание АТФ, нМ/млн клеток гепатоциты 91± 2 15±2 17 ±0.2 18,9 ±3,7 После 3 сут хранения при 4°С Известная Предлагаемая среда среда 50 ± 4 65 ±5 45 ±5 55 ± 3 8,35 ±1,8 8,0 ±1,0 5.3 ±0.2 5,0 • • 0.3 + Таблица 2 Метаболическое состояние консервированных клеток после нормотермической инкубации (п=6) Параметры Жизнеспособность, % ^Скорость э н д о г е н н о г о д ы х а н и я , |нМОг/млн клеток |Содержание АТФ, нМ/млн клеток (Степень связанности ПДГ, мкг/млн. 1 мг белка Редактор Н.Рогулич До иню/бации Предлагае- Известная мая среда среда 89 ± 3 80 ±2 | После w кубации Предлагае- Известная ! мая среда среда 1 90 ± 2 65 ±5 12.2 ± 2 , 8 16 ±2,6 8,3 ±2,0 10 ±2 15,5 ±3,5 33 ±3,1 10 ±2 15 ±2 4,3 ±0,3 3,2 ±2 4,9 ±0.5 3,0 ± 0,3 Составитель А.Романченко Техред М.Моргентал Корректор С.Патрушева твенного комитета по изобретениям и открытиямгариГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская неб.. 4/5 »дателмжмй комбинат "Патент", г. Ужгород, уя.Гагарина,