Спосіб імунобіосенсорного визначення ентеротоксинів escherichia coli

Спосіб кількісного визначення ентеротоксинів Е. соlі за допомогою імунобіосенсора, що включає приготування суміші досліджуваного розчину з 3 включає використання біотрансд'юсера на основі часток монодисперсних полістиролових латексів з діаметром 0,31 мкм, іммобілізованих біспецифічними антитілами до кон'югату ентеротоксинів [Пат. А61К 39/108 Україна. Спосіб виготовлення гіперімунної антитоксичної сироватки крові до кон'югату термостабільного і термолабільного ентеротоксинів Е.соli /Сухарев Ю. С.-№30128; заявлено 06.11.2007; опубл. 11. 02. 2008.-бюл. №3], який розпізнає аналізовані молекули токсинів, а фізичний трансд'юсер- перетворює і реєструє інформацію про міру каламутності розчину по інтенсивності світлового потоку розсіюваного завислими частками латексів, що аглютинують під дією ентеротоксинів, за допомогою фотоелектричного нефелометра. Використання способу визначення ентеротоксинів за допомогою імунобіосенсора дає змогу аналізувати складні суміші на присутність ентеротоксинів Е.соli, без передчасної їх очистки; виявляти дуже низькі концентрації ентеротоксинів у малих зразках; здійснювати експрес-діагностику колібактеріозу, що дозволяє своєчасно проводити протиепідеміологічні і профілактичні заходи, а також здійснювати епізоотологічний моніторинг за присутністю і розповсюдженням токсигенних штамів кишкової палички у навколишньому середовищі, що відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином. Біспецифічні антитіла до кон'югату ентеротоксинів Е.соli, вилучені за допомогою імуносорбенту з гіперімунних антитоксичних сироваток крові або молозива, розводять в гліциновому буфері до одержання 1,0-1,2% концентрації, а частки монодисперсних полістиролових латексів з діаметром 0,31 мкм - у співвідношенні 1:3 гліциновим буфером, рН-8,0-8,2, потім змішують рівні об'єми розчинів латексів і антитоксинів, суміш витримують протягом 1-2 годин при 37°С періодично струшуючи, після чого додають дві частини гліцинового буфера, який містить 0,5-1,0 % гліцерину і витримують у холодильнику 3-5 днів при 4 °С; змішують рівні об'єми досліджуємої рідини і латексного біотрансд'юсера; за допомогою нефелометра, який використовують у ролі фізичного трансд'юсера, реєструють інформацію про вміст ентеротоксинів, по інтенсивності світлового потоку розсіюваного завислими частками іммобілізованих антитілами латексів, що аглютинують під дією ентеротоксинів; у контролі використовують біотрансд'юсер виготовлений з латексів іммобілізованих імуноглобулінами нормальної кролячої сироватки крові, які не реагують з ентеротоксинами; різниця у показниках розсіювання світла між дослідними і контрольними зразками свідчить про наявність в досліджуємих пробах ентеротоксинів Е.соli. Приклад 1. Як досліджуваний матеріал для визначення ентеротоксинів, використовували фекалії хворих на діарею і вміст тонкого відділу кишечника 58052 4 полеглих тварин. Кишковий вміст і фекалії центрифугували при 4000-6000g протягом 20-40 хвилин, збирали супернатант і концентрували його у 5 разів ПЕГ з молекулярною масою 35000-40000 D. Змішували рівні об'єми досліджуємої рідини і латексного біотрансд'юсера. При наявності у реакційній суміші гомологічних токсичних речовин наступала аглютинація часток латексів. В контролі використовували біотрансд'юсер, виготовлений з латексів іммобілізованих імуноглобулінами нормальної кролячої сироватки крові, які не реагували з ентеротоксинами Е.соli. Різниця у показниках розсіювання світла між дослідними і контрольними зразками, що реєструвалася нефелометром 2100N (НАСН), свідчила про наявність ентеротоксинів Е.соli, (табл.1.). Приклад 2. Для кількісного визначення ентеротоксинів в досліджуємих зразках готували серію стандартних розведень ST-ентеротоксина Е.соli і будували калібровочну криву залежності величини розсіювання світла від середньої концентрації ентеротоксинів (n=4). В системі координат у вибраному масштабі по осі ординат відкладали одержанні значення одиниць розсіювання світла, а по осі абсцис-відповідні значення концентрації ентеротоксина, (фіг. 1.). Приклад 3. Специфічність латексного імунобіосенсора, т.т. здатність визначати тільки ту речовину, для визначення якої він розроблений, була підтверджена шляхом постановки тесту з безклітинним супернатантом Proteus vulgaris і стерильним середовищем культивування токсигенних штамів Е.соlі. Змішували рівні об'єми досліджуємої рідини і латексного біотрансд'юсера і визначали показники розсіювання світла нефелометром 2100N (НАСН). Величина розсіювання світла безклітинного супернатанта P.vulgaris-1,0±0,85 NTU і стерильного середовища культивування токсигених штамів - 6,5±0,91 NTU достовірно не відрізнялася від контролю - 5,0±0,91 NTU, (Р  0,1), (табл.2.). Основними перевагами латексного імунобіосенсора є: автоматизація обліку і аналізу одержаних даних, що виключає фактор суб'єктивності при візуальній оцінки результатів досліджень; специфічність-здатність аналізувати складні суміші на присутність ентеротоксинів без передчасної їх очистки; чутливість, здатність кількісно визначати дуже низькі концентрації ентеротоксинів у малих зразках; швидка відповідь; безпека при використанні; точність результатів; доступність для масового виробництва, можливість здійснювати експрес-діагностику колібактеріозу, що дозволяє своєчасно проводити протиепідеміологічні і профілактичні заходи, а також здійснювати епізоотологічний моніторинг за присутністю і розповсюдженням токсигенних штамів кишкової палички у навколишньому середовищі. 5 58052 6 Таблиця 1 Концентрація ентеротоксинів Е.соlі в фекаліях хворих і вмісті тонкого відділу кишечника полеглих телят, визначаєма імунобіосенсором. Досліджуваний зразок Фекалії Вміст кишечника Контроль Величина розсіювання світла (шкала нефелометра) 75,0 100,0 5,0 Концентрація ентеротоксина (мкг/мл) 3,12 ±0,74 6,24 ± 0,85 Pд-к  0,1  0,1 Таблиця 2 Величина розсіювання світла (NTU) безклітинного супернатанту P.vulgaris, стерильного середовища культивування токсигенних штамів Е.соlі і контроля, визначаєма за допомогою нефелометра. Досліджуєма речовина Безклітинний супернатант P.vulgaris Стерильне середовище культивування Е.соlі Контроль NТU-нефелометричні одиниці каламутності. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Величина розсіювання світла (NTU) X ± s, n=4 7,0 ± 0,85 6,5 ±0,91 5,0 ±0,91 Підписне Pд-к 0,1 0,1 – Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601