Спосіб контрастування ультратонких зрізів для трансмісійної електронної мікроскопії при проведенні експериментальних та клінічних досліджень

Спосіб контрастування ультратонких зрізів для трансмісійної електронної мікроскопії при проведенні експериментальних та клінічних досліджень, що включає обробку електронномікроскопічних сіточок із зразками препарату шляхом нанесення на них барвників, промивку електронномікроскопічних сіточок з наступним їх висушуванням, який відрізняється тим, що обробку електронномікроскопічних сіточок проводять в чотири етапи, для чого використовують щонайменше чотири непрозорих контейнери, ємність з тримачами для електронномікроскопічних сіточок, як ємність застосовують кришку, в верхній частині якої виконані щонайменше чотири пази для вертикально розташованих тримачів із електронномікроскопічними сіточками, при цьому кришка щільно прилягає до кожного із контейнерів, на першому етапі електронномікроскопічні сіточки поміщають в пази тримачів на кришці, фіксують їх в цих пазах і занурюють кришку з тримачами, де знаходяться електронномікроскопічні сіточки, в перший контейнер, U 2 58290 1 3 падіння солей барвників на поверхні об'єкта і необхідністю використання захисних матеріалів для запобігання опромінення розчинів сонячними променями. В основу корисної моделі покладено завдання зменшити час контрастування великого за об'ємом матеріалу, зменшити контакт реактивів з повітрям та сонячним світлом, зменшити травмування поверхні ультратонких зрізів, зменшити кількість артефактів при перегляді контрастованих об'єктів на трансмісійному електронному мікроскопі. Поставлене завдання вирішується тим, що процес контрастування ультратонких зрізів згідно корисної моделі відбувається в використанням чотирьох непрозорих контейнерів з інертного матеріалу об'ємом 17,5 см3 та щільно прилягаючої кришки з тримачами для сіточок. Сіточки для контрастування поміщають в пази тримачів кришки контейнерів. Після фіксації сіточок, кришку поміщають в контейнер з першим барвником, в якості якого виступає 2 % розчин уранілацетату, далі кришку з тримачами для електронномікроскопічних сіточок переміщають в другий контейнер де сіточки промивають в бідистильованій воді, потім кришку переносять в контейнер з другим барвником, яким є розчин цитрату свинцю та після цього кришку з тримачами для електронномікроскопічних сіточок переносять в третій контейнер де сіточки промивають розчином Соренсона. Після промивки сіточки підсушують на широкому фільтрувальному папері та переносяться в магазин для зберігання сіточок. Магазин зі знятою кришкою поміщають в термостат де відбуваються процеси видалення остаточної вологи з препаратів при температурі 35 – 37 °С протягом 12 - 24 годин. Використання способу, що заявляється, з усіма суттєвими ознаками, включаючи відмінні, дозволяє проводити контрастування великої кількості матеріалу одночасно. Використання непрозорого контейнеру та щільний контакт кришки з контейнером перешкоджає контакт матеріалу з повітрям та сонячними променями, що зменшує кількість артефактів при перегляді зразків в електронному мікроскопі. Фіксація сіточок на кришці контейнеру зменшує травматизацію зразків та підвищує їх якість. Таким чином, спосіб що заявляється, дозволяє вирішити поставлене завдання. Графічна частина способу пояснює суть корисної моделі, де на фіг. показаний один з чотирьох контейнерів для контрастування ультратонких зрізів. Комплект із чотирьох контейнерів включає: сам контейнер 1, в який вставляється кришка 2 з нижньої поверхні якої знаходяться щонайменше чотири тримачі 3, в яких знаходяться пази 4 для електронномікроскопічних сіточок. Проведення контрастування за допомогою контейнера для контрастування ультратонких зрізів для трансмісійної електронної мікроскопії здійснюють таким чином. Електронномікроскопічні сіточки зі зразками, наприклад кістки, обробляють в чотири етапи. Для обробки електронномікроскопічних сіточок зі зразками використовують чотири однакових контейнери 1, кожен об'ємом 17,5 мм3, кришку 2. У верхній 58290 4 частині кришки 2 виконані щонайменше чотири вертикально розташованих тримачів 3 довжиною 1,5 мм з пазами глибиною 1,5 - 2,0 мм. Кришка 2 щільно прилягає до кожного із чотирьох контейнерів 1, що унеможливлює контакт реагентів з атмосферним повітрям. Контейнери 1 виготовлені із інертного полімерного непрозорого матеріалу, а кришка 2 - із пінополістеролу. Верхню частину кришки 2 маркують літерами А, В, С, D відповідно до кількості тримачів та цифрами від 1 до відповідної кількості пазів. На першому етапі тримачі 3 із електронномікроскопічними сіточками зі зразками фіксують в пазах 4 кришки і занурюють в перший контейнер 1. В першому контейнері 1 електронномікроскопічні сіточки зі зразками обробляють протягом 30-60 хвилин 2 % розчином уранілацетату, об'єм розчину складає 17 мл. Потім кришку 2 із електронномікроскопічними сіточками зі зразками знімають із першого контейнеру 1 і надівають на другий, аналогічний першому контейнеру, контейнер. На другому етапі у другому контейнері 1, заповненому бідистильованою деіонізованою водою проводять промивку електронномікроскопічних сіточок зі зразками від залишків уранілацетату. Процес промивки проводять двічі по 15 хвилин, змінюючи воду у другому контейнері 1. Далі кришку 2 із електронномікроскопічними сіточками зі зразками знімають із другого контейнеру 1 і надівають та третій контейнер 1. На третьому етапі електронномікроскопічні сіточки зі зразками обробляють барвником - розчином цитрату свинцю. Обробку здійснюють протягом 30-60 хвилин. Потім кришку 2 із електронномікроскопічними сіточками знімають з третього контейнеру 1 і надівають на четвертий контейнер 1. На четвертому етапі електронномікроскопічні сіточки зі зразками промивають буферним розчином Соренсона. Промивка триває 10 хвилин після чого буферний розчин Соренсона зливають, а в четвертий контейнер 1 заливають бідистильовану деіонізовану воду, в якій електронномікроскопічні сіточки зі зразками знаходяться протягом 15 хвилин. Після промивки електронномікроскопічні сіточки зі зразками підсушують на широкому фільтрувальному папері протягом 20-30 хвилин, потім електронномікроскопічні сіточки зі зразками переносять в магазин для зберігання сіточок (на графічній частині не показаний). Магазин зі знятою кришкою 2 поміщають в термостат, де відбувається процес видалення вологи з препаратів при температурі 35-37 °С протягом 1224 годин. Запропонований спосіб є детальним та точним, дозволяє проводити контрастування великої кількості матеріалу одночасно. Використання непрозорого контейнеру та щільний контакт кришки з контейнером перешкоджає контакту матеріалу з повітрям та сонячними променями, що зменшує кількість артефактів при перегляді в електронному мікроскопі. Фіксація сіточок на кришці контейнеру зменшує травматизацію зразків та підвищує їх якість. За допомогою запропонованого контейнеру для контрастування ульратонких зрізів для трансмісійної електронної мікроскопії на кафедрі анатомії людини проведене контрастування 186 сіточок 5 58290 зі зразками кістки, легень, крові, регенерату. Це дозволило зменшити кількість артефактів при перегляді зразків на електронному мікроскопі та про Комп’ютерна верстка М. Мацело 6 водити одночасне контрастування більшої кількості зразків при вивчення ультраструктури досліджуваних об'єктів. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601