Спосіб визначення деструкції ендотеліальних частин в кров’яному руслі

Спосіб визначення деструкції ендотеліальних частин в кров'яному руслі шляхом осадження тромбоцитів плазми крові, з подальшим аналізом експресії антигенів ендотеліоцитів в надосадовій рідині на проточному цитофлюориметрі, який відрізняється тим, що як антитіла використовуються два типи моноклональних антитіл проти поверхневих специфічних антигенів ендотеліоцитів CD32 та CD40, мічених різними флюорисцентними барвниками. (19) (21) u201008819 (22) 15.07.2010 (24) 26.04.2011 (46) 26.04.2011, Бюл.№ 8, 2011 р. (72) КАЙДАШЕВ ІГОР ПЕТРОВИЧ, КУЦЕНКО НЕЛЯ ЛЕОНІДІВНА, САВЧЕНКО ЛЮДМИЛА ГАВРИЛІВНА, КУЦЕНКО ЛАРИСА ОЛЕКСАНДРІВНА, КАЙДАШЕВА ЄЛЬВІРА ІЛЛІВНА, СОЛОХІНА ІНГА ЛЕОНІДІВНА, МАМОНТОВА ТЕТЯНА ВАСИЛІВНА (73) ВИЩИЙ ДЕРЖАВНИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД УКРАЇНИ "УКРАЇНСЬКА МЕДИЧНА СТОМАТОЛОГІЧНА АКАДЕМІЯ" 3 58648 Недоліком існуючого способу є визначення відносно специфічного одного антигену ендотеліоцитів. Використання одного типу моноклональних антитіл не завжди дає об'єктивну інформацію про ту або іншу популяцію клітин, так як кожна клітина несе на своїй поверхні одночасно декілька типів антигенів, а один і той же антиген може експресуватися декількома типами клітин одного організму. Антитіла до CD31 зв'язуються із моноцитами, тромбоцитами, гранулоцитами, ендотеліоцитами, окремими популяціями лімфоцитів. В основу корисної моделі поставлена задача створити спосіб визначення деструкції ендотеліальних частин в кровяному руслі, шляхом удосконалення відомого, використовуючи одночасно два типи моноклональних антитіл проти поверхневих антигенів ендотеліальних клітин. При цьому виявляються специфічні ендотеліальні частинки серед іншої популяції клітин та їх обломків, що також можуть експресувати на своїй поверхні той чий інший антиген, характерний для ендотеліальних клітин. Поставлена задача вирішується шляхом створення способу визначення деструкції ендотеліальних частин в кровяному руслі, шляхом осадження тромбоцитів плазми крові, з послідуючим аналізом надосадової рідини на проточному цитофлюориметрі, який відрізняється тим, що в якості антитіл використовуються два типи моноклональних антитіл проти поверхневих специфічних антигенів ендотеліоцитів, мічених різними флюорисцентними барвниками. Запропонований спосіб дозволяє високоспецифічно виявляти ендотеліальні мікрочастинки як один із перспективних маркерів пошкодження ендотелію при серцево-судинній патології, що суттєво підвищить ефективність діагностичнопрогностичних заходів в кардіології та ендокринології. Заявлений спосіб виконується наступним чином: Концентрацію ендотеліальних мікрочастин визначали за методом J. Hladovec в нашій модифікації: кров з ліктьової вени отримували додаючи 3,8% трьохзаміщеного цитрату натрію у співвідношенні 1:9. Для отримання збагаченої тромбоцитами плазми відразу після взяття кров центрифугували при 1000 об./хв. протягом 10 хвилин. Потім до 2 мл отриманої плазми додавали 0,4 мл 2мМ 4 аденозиндифосфату динатрієвої солі, обережно перемішуючи протягом 10 хвилин, після чого центрифугували при 1000 об./хв. протягом 10 хвилин для осаду агрегатів тромбоцитів. В надосадо+ + вій рідині визначали CD32 CD40 - мікрочастинки методом проточної цитофлюориметрії (ЕРІХ LXMCL (Beckman Coulter, США), використовуючи програму System II™ software. Для збудження флюорисценції використовували аргоновий лазер з довжиною хвилі 488 нм. Додатково до флюорисцентних параметрів проводили реєстрацію прямого та бокового світорозсіювання клітин. Для визначення фенотипу ендотеліальних мікрочастин периферичної крові були використані моноклональні антитіла (МкАТ) (мишині IgG) до поверхневих антигенів, які мічені різними флюорисцентними барвниками: до CD32 мічені фікоеретрином (RPE), до CD40 мічені флюорисцеінізотіоционатом (FITC). Антитіла до CD32 зв'язуються із моноцитами, гранулоцитами, В лімфоцитами, тромбоцитами, ендотеліоцитами. Антитіла до CD40 зв'язуються із В лімфоцитами, моноцитами, ендотеліоцитами, фібробластами, кератіноцитами. Для ізотипічного контролю використовували мишині IgG, кон'юговані FITC, RPE та PE-TR. Враховуючи роль судинного ендотелію (порушення його функції) у прогресуванні серцевосудинних захворювань, нами були досліджені маркери пошкодження ендотеліоцитів (CD32+CD40+ мікрочастинки) у хворих з метаболічним синдромом та цукровим діабетом. Показано, що у хворих з підтвердженим діагнозом метаболічного синдрому кількість CD32+CD40+ мікрочастинок була 4,54107 /л, що двічі більше показників практично здорових осіб (Табл.). Підвищений рівень цих ендотеліальних мікрочастинок нами був виявлений і у пацієнтів з іншою судинною патологією (цукровий діабет 2 типу та в поєднанні з метаболічним синдромом), де одним із доведених патогенетичних механізмів розвитку є ендотеліальна дисфункція. + + Слід відмітити, що підвищений рівень CD32 CD40 мікрочастинок корелював з підвищеною концентрацією великого ендотеліну в сироватці крові цих пацієнтів. Враховуючи, що цей попередник ендотеліну є маркером пошкодження ендотелію, слід стверджувати, що виявлений нами підвищений рівень CD32+CD40+ - мікрочастинок є маркером пошкодження ендотелію. Таблиця Дослідження ендотеліальної дисфункції у обстежених пацієнтів на момент госпіталізації (М±m) Групи хворих Ендотелій, фмоль/мл Практично здорові особи, (n=10) Пацієнти з метаболічним синдромом, (n= 17) Пацієнти з цукровим діабетом 2 типу, (n=17) Пацієнти з цукровим діабетом 2 типу на фоні метаболічного синдрому, (n=17) 0,1±0,05 0,32±0,16* 0,38±0,25* Циркулюючі CD32+CD40+ мікрочастинки (• 107/л) 2,1±0,2 4,54±2,06* 4,57 ±1,9* 0,34±0,25* 4,55±1,97* Примітки: * - вірогідно щодо показників практично здорових осіб 5 58648 Позитивний результат від заявленого способу визначення деструкції ендотеліальних частин в кровяному руслі полягає у виявленні мікрочастинок серед ендотеліоцитів, які на своїй поверхні Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 6 одночасно експресують два специфічних антигена CD32 та CD40. Таким чином, визначення CD32+CD40+ - мікрочастинок - є специфічним маркером пошкодження ендотеліоцитів. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601