Спосіб визначення апоптозу ендотеліальних клітин

Спосіб визначення апоптозу ендотеліальних КЛІТИН, який відрізняється тим, що підраховують у периферійній крові абсолютну кількість лейкоцитів в одиниці об'єму, визначають кількість ДНК загаль Винахід стосується медицини, а саме лабораторної діагностики, і може бути використаний для визначення апоптозу ендотеліальних клітин у хворих з патологією внутрішніх органів. Аполтоз ендотеліальних клітин відіграє ключову роль у патогенетичних ланках безлічі захворювань внутрішніх органів людини. Програмована. загибель ендотелію, приводячи до порушення цілісності і гомогенності ендотеліапьноі вистілки судин, здатна впливати практично на усі функції ендотелію судин - порушення рецепції механічних сигналів від крові, що рухається, і як слідство - порушення вазорегулюючої функції судин, локальна активація згортальної системи крові на місці зполтотичної загибелі клітин ендотелію і як слідство підвищення ризику тромботичних станів і тромбоемболічних ускладнень, зменшення числа ендотеліальних клітин у результаті їх апоптозу і як слідство - зменшення числа продукуємих активних речовин із наступною дизрегуляцією процесів проліферації в судинній стінці, зміна судинно-клітинної взаємодії Э порушенням процесів трансмиграції клітинних елементів крові відносно судинної стінки. Існуючий розрив між нашими уявленнями про роль і місце апоптозу ендотеліальних клітин у процесах ініціації, прогресування І самопідтримання патологічних процесів, що відбуваються в організмі людини, і можливостями вивчення наявності і питомої ваги апоптотичної загибелі ендотелію в патогенетичних ланках розвитки хворобливих ста ноприйнятими способами в одиниці об'єму плазми, підраховують в одиниці об'єму абсолютну кількість алоптотичних лейкоцитів, які забарвлюються пропідіумом йодидом, знаходять кількість ДНК, яка приходиться на апоптотичні лейкоцити шляхом перемноження абсолютної кількості в одиниці об'єму . аполтотичних лейкоцитів та вмісту ДНК в одному • лейкоциті (8,0 пг) та вираховують коефіцієнт апоптозу ендотеліальних клітин як виражену у відсотках до загальної кількості ДНК різницю між загальною кількістю ДНК та ДНК, яка приходиться на апоптотичні лейкоцити. нічних умовах, тому розробка способом визначення апоптозу ендотеліальних клітин є актуальною проблемою медицини. Відомий спосіб визначений апоптозу ендотеліальних клітин, що полягає у наступному: 1. Отримання первинно тріпсинизованої культури свинячих аортальних ендотеліальних клітин стандартним способом. 2. Культивування отриманих ендотеліальних клітин стандартним способом. 3. Додавання до культиваційного середовища сполук, вплив яких вивчається на процеси апоптозу ендотеліальних клітин. 4. Зняття культивуємих ендотеліальних клітин з поверхні, на якій вони культивуються стандартними способами. 5 'Забарвлення знятих ендотеліальних клітин за допомогою аннексіну V, коньюгованого з флюоресцинізотіоцианатом. 6. Підрахунок забарвлених (апоптотичних) ендотеліальних клітин за допомогою проточного цитофлюоріметру стандартним способом. (DeMeester S.L , Qiu Y., Bucman T.G. et all. Nitric oxide inhibits stress-induced endothelial cell apoptosis // Crit. Care Med. - 1998,-Vol. 26 (9).- P. 1500-1509). Суттєвих загальних ознак між аналогом та способом, що заявляється, немає. Однак не дивлячись на те, що існує принципова можливість визначення апоптозу ендо• теліальних клітин відповідно ло ааінячрмпгп гпп О ю со О) ними показниками до людських клітин ендотелію свинячих ендотеліальних клітин) також звужує діапазон застосування даного способу, не дозволяючи проводити визначення апоптозу ендотеліальних клітин в КЛІНІЧНИХ умовах у досліджуемих осіб, для яких визначення апоптозу ендотеліальних клітин мало б діагностичну і (або} прогностичну цінність Крім того, проводячи дослідження згідного цього способу, ми не маємо можливості визначати вже існуючий апоптоз ендотеліальних клітин, а можемо лише вивчити індукований апоптоз ендотелію у відповідь на штучно привнесений фактор Таким чином, використання зазначеного способу не дозволяє проводити дослідження апоптозу ендотепіальних клітин в клінічних умовах В доступній нам літературі ми не зустріли опису способу визначення апоптозу ендотеліальних клітин. В основу винаходу поставлено задачу розробки способу визначення апоптозу ендотеліальних клітин в клінічних умовах у людини Поставлена задача вирішується тим, що 8 способі визначення апоптозу ендотеліальних клітин новим є те, що підраховують у периферічній крові абсолютну кількість лейкоцитів в одиниціоб'єму, визначають кількість ДНК загальноприйнятими способами в одиниці об'єму плазми, підраховують в одиниці об'єму абсолютну кількість апоптотичних лейкоцитів, які забарвлюються пролідіумом йодидом, знаходять кількість ДНК, яка приходиться на апоптотичні лейкоцити шляхом перемноження абсолютної кількості в одиниці об'єму апоптотичних лейкоцитів та вмісту ДНК в одному лейкоциті (8,0 пг) та вираховують коефіцієнт апоптозу ендотеліальних клітин як виражену у відсотках до загальної кількості ДНК різницю між загальною кількістю ДНК та ДНК, яка приходиться на апоптотичні лейкоцити. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає в наступному; у нормальних умовах у крові не міститься вільної ДНК Вона може з'являтися в результаті некрозу при будь-яких гнійних процесах, коли йде масивна загибель лейкоцитів у вогнищах запалення і звільнення ДНК у циркулюючу кров, при аутоімунних процесах (наприклад, системний червоний вовчак, ревматоїдний артрит, системні васкуліти та інше), коли відбувається аутоагресія імунокомпетентних клітин проти власних клітин організму з загибеллю як останніх, так і самих клітин-ефекторів. Інший шлях появи ДНК у циркулюючої крові - аполтотична загибель клітин, причому в силу анатомічних особливостей організації кровоносного русла, ДНК у циркулюючій крові може з'явитися тільки з двох джерел. Перший Із них - ядровмісні клітини крові • лейкоцити, шо ГИНУТЬ за допомогою апоптозу безпосередньо в ний вміст ДНК, що не тільки значно спрощує процедуру дослідження, але й дозволяє розглядати і кількісні аспекти досліджуваного явища на відміну від якісної оцінки наявності чи відсутності апоптотичної загибелі клітин без розрізнення їхнього походження при знаходженні в крові фрагментів ДНК Однак необхідно помітити, що при цьому потрібно відбирати хворих без ознак гнійних або аутоїмуних процесів, щоб «некротична» ДНК не завищила показники. Приймаючи до уваги джерела появи ДНК у циркулюючої' крові, для визначення апоптозу саме ендотеліальних клітин, необхідно кількісно оцінити апоптоз лейкоцитів. Це можливо при використанні специфічного барвника пропідіума йодиду, що зафарблює винятково апоптотичні клітини, які містять гіподиплоідну ДНК і підвищену проникність як клітинної мембрани, так і ядерної мембрани (специфічні ознаки, що характеризують процес апопотичної загибелі клітин). Знаючи вміст ДНК в одному лейкоциті, можна порахувати, яку кількість ДНК привноситься в загальну масу циркулюючої ДНК через апоптотичні лейкоцити. Не приймаючи до оцінки цю кількість ДНК, можна з великим ступенем точності, достовірності і відтворюванності результатів дослідження оцінити апоптоз винятково ендотеліальних клітин. Для визначення показника норми було обстежено 43 практично здорових осіб, серед обстежених здорових осіб були представлені різні вікові групи (згідно рекомендацій ВООЗ), середній вік склав 41,4±12,3 року, жінок було 18(41,86%), чоловіків - 25 (58,14%) Після обчислення результатів обстеження групи здорових осіб коефіцієнт апоптозу ендотеліальиих клітин склав 12,45±0,81%. Спосіб здійснюється слідуючим чином: 1 Шляхом венепункції набирають у шприц декілька мілілітрів крові. 2. Змішують кров з антикоагулянтом - розчином гепарину у співвідношенні і крапля на 1 мл крові З Підраховують абсолютну кількість лейкоцитів в одиниці об'єму крові 4. Розділяють кров на фракцію, яка вміщає лейкоцити та плазму. 5. В одиниці об'єму отриманої плазмі визначають КІЛЬКІСТЬ ДНК загальноприйнятими способами виражаючи її в одиницях маси. 6. Змішують в пробірках 2,5*105 лейкоцитів та 70% етанол та витримують протягом 1 години. 7. Центрифугують пробірки при 500 обертах за хвилину впродовж 7 хвилин для зсідання лейкоцитів. 8. Зсівші клітини ресуспендують в 1 мл гіпотонічного розчину пропідіума йодиду такого складу - 5 мг/мл пропідіума йодиду, 0,1% цитрат натрію, 0,1% тритон Х-100. • . 9. Інкубують в темряві 15 хвилин. 10. Центрифугують пробірки при 500 обертах за хвилину впродовж 7 хвилин для зсідання мазку. 14. Визначають кількість ДНК, яка ходиться на апоптотичні лейкоцити шляхон ремноження абсолютної кількості в одиниці о апоптотичних лейкоцитів та 8,0 пг (вміст ДНК ному лейкоциті) та виражають значення в oj цях маси. 15. Вираховують коефіцієнт апоптозу і теліальних клітин як виражену у відсотках д пальної кількості ДНК різницю між загальною кістю ДНК та ДНК, яка приходиться на апопто лейкоцити. Приклад: Хворий С , 43 років, надійи кардіологічне відділення Запорізької обласно нічної лікарні з скаргами на запаморочення, г< ний біль, «мільтішиння цяток» перед очами, в вухах, задишку при фізичному нааанта» Вважає себе хворим протягом 8 років, коли і ше, без видимої причини, було зареєстрован сову кровотечу, яка супроводжувалася підви ням артеріального тиску до 190 та 120 мм р Згодом хворий неодноразово знаходився на ціонарному лікуванні з приводу гіпертонічної роби, одержував амбулаторну терапію |}-бло рами і діуретиками. За тиждень до надходжеі клініку, після сильного психоемоційного потр ня, з'явилися вищезазначені скарги на тлі вж цифр артеріального тиску (до 180 і 110 мм рт і хворий був госпіталізований для куліровані пертонічного криза та корекції проводимо! те| Анамнез життя - без особливостей, мати хвс страждала гіпертонічною хворобою, іншої СПІ вої патології в родині не виявлено Пацієнт пг протягом 13 років, Інші шкідливі звички запер алергологічний анамнез не обтяжений. Об'єкт спостерігаються наступні зміни. Артеріальний в момент надходження 180 і 100 мм рт.ст на г 185 і 110 мм рт. ст. на правій плечових арте пульс 84 ударів в хвилину, задовільних власті тей. При пальпації верхівний поштовх визнач, ~ся на 2-2, 5 см ззовні від середньоключичної г лівої сторони в 6 міжребірьї, поширений, збіл ний по висоті, посилений. Перкуторно - розш» ня границь відносної серцевої тупості, аускуі тивно - діяльність серця правильна, посилеї Відкрите акціс УКРАЇНА UA (ID 35090 аз) А (51) 6G01N33/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ 1 НАУКИ УКРАЇНИ ОПИС ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД видається під відповідальність власника патенту (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ АПОПТОЗУ ЕНДОТЕЛІАЛЬНИХ КЛІТИН (21)99084569 (22)10.08.1999 (24) 15.03.2001 (46) 15 03.2001, Бюл. № 2, 2001 р. (72) Черепок Олександр Олексійович, Полівода Сергій Миколайович (73) ЧЕРЕПОК ОЛЕКСАНДР ОЛЕКСІЙОВИЧ, ПОЛІВОДА СЕРГІЙ МИКОЛАЙОВИЧ (57) Спосіб визначення апоптозу ендотеліальних клітин, який відрізняється тим, що підраховують у периферічній крові абсолютну кількість лейкоцитів в одиниці об'єму, визначають кількість ДНК загаль ноприйнятими способами в одиниці об'єму плазми, підраховують в одиниці об'єму абсолютну кількість апоптотичних лейкоцитів, які забарвлюються пропідіумом йодидом, знаходять кількість ДНК, яка приходиться на апоптотичні лейкоцити шляхом перемноження абсолютної кількості в одиниці об'єму апоптотичних лейкоцитів та вмісту ДНК в одному лейкоциті (8,0 пг) та вираховують коефіцієнт апоптозу ендотеліальних клітин як виражену у відсотках до загальної кількості ДНК різницю між загальною кількістю ДНК та ДНК, яка приходиться на апоптотичні лейкоцити. Винахід стосується медицини, а саме лабораторної' діагностики, і може бути використаний для визначення апоптозу ендотеліальних клітин у хворих з патологією внутрішніх органів. Апоптоз ендотеліальних клітин відіграє ключову роль у патогенетичних ланках безлічі захворювань внутрішніх органів людини. Програмована загибель ендотелію, приводячи до порушення цілісності і гомогенності ендотеліальної вистілки судин, здатна впливати практично на усі функції ендотелію судин - порушення рецепції механічних сигналів від крові, що рухається, і як слідство - порушення вазорегулюючої функції судин, локальна активація згортальної системи крові на місці апоптотичної загибелі клітин ендотелію і як слідство підвищення ризику тромботичних станів і тромбоемболічних ускладнень, зменшення числа ендотеліальних клітин у результаті їх апоптозу і як слідство - зменшейня числа продукуємих активних речовин із наступною дизрегуляцією процесів проліферації в судинній стінці, зміна судинно-клітинної взаємодії з порушенням процесів трансмиграції клітинних елементів крові відносно судинної стінки. Існуючий розрив між нашими уявленнями про роль і місце апоптозу ендотеліальних клітин у процесах ініціації', прогресування і самопідтримання патологічних процесів, що відбуваються в організмі людини, і можливостями вивчення наявності і питомої ваги апоптотичної загибелі ендотелію в патогенетичних ланках розвитки хворобливих станів в організмі людини, пояснюється відсутністю на сьогоднішній день можливості визначати апоптозу ендотеліальних клітин у конкретного хворого в клі нічних умовах, тому розробка способом визначення апоптозу ендотеліальних клітин є актуальною проблемою медицини. Відомий спосіб визначений апоптозу ендотеліальних клітин, що полягає у наступному: 1. Отримання первинно тріпсинизованої культури свинячих аортальних ендотеліальних клітин стандартним способом. 2. Культивування отриманих ендотеліальних клітин стандартним способом. 3. Додавання до культиваційного середовища сполук, вплив яких вивчається на процеси апоптозу ендотеліальних клітин. 4. Зняття культивуємих ендотеліальних клітин з поверхні, на якій вони культивуються стан* дартними способами. 5. Забарвлення знятих ендотеліальних клітин за допомогою аннексіну V, коньюгованого з флюоресцинізотіоцианатом. 6. Підрахунок забарвлених (апоптотичних) ендотеліальних клітин за допомогою проточного цитофлюоріметру стандартним способом. (DeMeester S.L., Qiu Y., Bucman T.G. et all. Nitric oxide inhibits stress-induced endothelial cell apoptosis // Crit. Care Med. -1998.-Vol. 26 (9).- P. 1500-1509). Суттєвих загальних ознак між аналогом та способом, що заявляється, немає. Однак не дивлячись на те, що існує принципова можливість визначення апоптозу ендотеліальних клітин відповідно до зазначеного способу, він має досить вузькі, строго обкреслені області застосування - тому що дозволяє тільки вивчати алоптоз ендотеліальних клітин у відпо О ф о ю со < 35090 відь на тестуемі біологічно активні речовини, у відповідь на зміну умов культивування тощо. Використання культури ендотеліальних клітин (навіть таких близьких за своїми структурно-функційними показниками до людських клітин ендотелію свинячих ендотеліальних клітин) також звужує діапазон застосування даного способу, не дозволяючи проводити визначення апоптозу ендотеліальних клітин в клінічних умовах у доспіджуємих осіб, для яких визначення апоптозу ендотеліальних клітин мало б діагностичну і (або) прогностичну цінність Крім того, проводячи дослідження згідного цього способу, ми не маємо можливості визначати вже існуючий апоптоз ендотеліальних клітин, а можемо лише вивчити індукований апоптоз ендотелію у відповідь на штучно привнесений фактор Таким чином, використання зазначеного способу не дозволяє проводити дослідження апоптозу ендотеліальних клітин в клінічних умовах. В доступній нам літературі ми не зустріли опису способу визначення апоптозу ендотеліальних клітин. В основу винаходу поставлено задачу розробки способу визначення апоптозу ендотеліальних клітин в клінічних умовах у людини. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення апоптозу ендотеліальних клітин новим є те, що підраховують у периферічній крові абсолютну кількість лейкоцитів в одиниці об'єму, визначають кількість ДНК загальноприйнятими способами в одиниці об'єму плазми, підраховують в одиниці об'єму абсолютну кількість апоптотичних лейкоцитів, які забарвлюються пропідіумом йодидом, знаходять кількість ДНК, яка приходиться на апоптотичні лейкоцити шляхом перемноження абсолютної кількості в одиниці об'єму апоптотичних лейкоцитів та вмісту ДНК в одному лейкоциті (8,0 пг) та вираховують коефіцієнт апоптозу ендотеліальних клітин як виражену у відсотках до загальної кількості ДНК різницю між загальною кількістю ДНК та ДНК, яка приходиться на апоптотичні лейкоцити. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає в наступному; у нормальних умовах у крові не міститься вільної ДНК. Вона може з'являтися в результаті некрозу при будь-яких гнійних процесах, коли йде масивна загибель лейкоцитів у вогнищах запалення і звільнення ДНК у циркулюючу кров, при аутоімунних процесах (наприклад, системний червоний вовчак, ревматоїдний артрит, системні васкуліти та інше), коли відбувається аутоагресія імунокомпетентних клітин проти власних клітин організму з загибеллю як останніх, так і самих клітин-ефекторів. Інший шлях появи ДНК у циркулюючої крові - апоптотична загибель клітин, причому в силу анатомічних особливостей організації кровоносного русла, ДНК у циркулюючій крові може з'явитися тільки з двох джерел. Перший із них - ядровмісні клітини крові - лейкоцити, що гинуть за допомогою апоптозу безпосередньо в кровоносному руслі, або в процесі крайового стояння лейкоцитів, відносячись після цього також у потік крові, другий - ендотеліальні клітини судин, що піддаються апоптозу in suti із вивільненням ядерного вмісту в кров, або які відриваються по током рухомої крові у вигляді апоптотичних тілець (так називаних «циркулюючі ендотеліальні клітини») так само з вимиванням ДНК. У запропонованому способі передбачається оцінювати сумарний вміст ДНК, що не тільки значно спрощує процедуру дослідження, але й дозволяє розглядати і кількісні аспекти досліджуваного явища на відміну від якісної оцінки наявності чи відсутності апоптотичної загибелі клітин без розрізнення їхнього походження при знаходженні в крові фрагментів ДНК. Однак необхідно помітити, що при цьому потрібно відбирати хворих без ознак гнійних або аутоімуних процесів, щоб «некротична» ДНК не завищила показники. Приймаючи до уваги джерела появи ДНК у циркулюючої' крові, для визначення апоптозу саме ендотеліальних клітин, необхідно кількісно оцінити апоптоз лейкоцитів. Це можливо при використанні специфічного барвника пропідіума йодиду, що зафарблює винятково апоптотичні клітини, які містять гіподиплоідну ДНК і підвищену проникність як клітинної мембрани, так і ядерної мембрани (специфічні ознаки, що характеризують процес апопотичної загибелі клітин). Знаючи вміст ДНК в одному лейкоциті, можна порахувати, яку кількість ДНК привноситься в загальну масу циркулюючої ДНК через апоптотичні лейкоцити. Не приймаючи до оцінки цю кількість ДНК, можна з великим ступенем точності, достовірності і відтворюваниості результатів дослідження оцінити апоптоз винятково ендотеліальних клітин. Для визначення показника норми було обстежено 43 практично здорових осіб, серед обстежених здорових осіб були представлені різні вікові групи (згідно рекомендацій ВООЗ), середній вік склав 41,4±12,3 року, жінок було 18 (41,86%), чоловіків - 25 (58,14%). Після обчислення результатів обстеження групи здорових осіб коефіцієнт апоптозу ендотеліальних клітин склав 12,45±0,81%. Спосіб здійснюється слідуючим чином: 1 Шляхом венепункції набирають у шприц декілька мілілітрів крові. 2. Змішують кров з антикоагулянтом - розчином гепарину у співвідношенні і крапля на 1 мл крові. З Підраховують абсолютну кількість лейкоцитів в одиниці об'єму крові. 4. Розділяють кров на фракцію, яка вміщає лейкоцити та плазму. 5. В одиниці об'єму отриманої плазмі визначають кількість ДНК загальноприйнятими способами виражаючи її в одиницях маси. 6. Змішують в пробірках 2,5*105 лейкоцитів та 70% етанол та витримують протягом 1 години. 7. Центрифугують пробірки при 500 обертах за хвилину впродовж 7 хвилин для зсідання лейкоцитів. 8. Зсівші клітини ресуспендують в 1 мл гіпотонічного розчину пропідіума йодиду такого складу - 5 мг/мл пропідіума йодиду, 0,1% цитрат натрію, 0,1% тритон X-100. 9. Інкубують в темряві 15 хвилин. 10. Центрифугують пробірки при 500 обертах за хвилину впродовж 7 хвилин для зсідання лейкоцитів. 11.3 осадку готують мазки. 12. Виготовлені мазки проглядають на люмінесцентному мікроскопі, підраховуючи виражену у відсотках кількість забарвлених лейкоцитів. 35090 13. Вираховують абсолютну кількість в одиниці об'єму апоптотичних (забарвлених пропідіумом йодидом) лейкоцитів виходячи з їх абсолютної кількості та процента забарвлених лейкоцитів в мазку. 14. Визначають кількість ДНК, яка приходиться на апоптотичні лейкоцити шляхом перемноження абсолютної кількості в одиниці об'єму апоптотичних лейкоцитів та 8,0 пг (вміст ДНК в одному лейкоциті) та виражають значення в одиницях маси. 15. Вираховують коефіцієнт апоптозу ендотеліальних клітин як виражену у відсотках до загальної кількості ДНК різницю між загальною кількістю ДНК та ДНК, яка приходиться на алоптотичні лейкоцити. Приклад: Хворий С , 43 років, надійшов в кардіологічне відділення Запорізької обласної клінічної лікарні з скаргами на запаморочення, головний біль, «мільтішиння цяток» перед очами, дзвін в вухах, задишку при фізичному навантаженні. Вважає себе хворим протягом 8 років, коли вперше, без видимої причини, було зареєстровано носову кровотечу, яка супроводжувалася підвищенням артеріального тиску до 190 та 120 мм рт. ст. Згодом хворий неодноразово знаходився на стаціонарному лікуванні з приводу гіпертонічної хвороби, одержував амбулаторну терапію р-блокаторами і діуретиками. За тиждень до надходження в клініку, після сильного психоемоційного потрясіння, з'явилися вищезазначені скарги на тлі високих цифр артеріального тиску (до 180 і 110 мм рт. ст.), і хворий був госпіталізований для купіровання гіпертонічного криза та корекції проводимо! терапії. Анамнез життя - без особливостей, мати хворого страждала гіпертонічною хворобою, іншої спадкової патології в родині не виявлено. Пацієнт палить протягом 13 років, інші шкідливі звички заперечує, алергологічний анамнез не обтяжений. Об'єктивно спостерігаються наступні зміни. Артеріальний тиск в момент надходження 180 і 100 мм рт.ст. на лівій і 185 і 110 мм рт. ст. на правій плечових артеріях, пульс 84 ударів в хвилину, задовільних властивостей. При пальпації верхівний поштовх визначаєтьх я на 2-2, 5 см ззовні від середньоключичної лінії з лівої сторони в 6 міжребірьї, поширений, збільшений по висоті, посилений. Перкуторно - розширення границь відносної серцевої тупості, аускультативно - діяльність серця правильна, посилений І тон на верхівці серця, в легенях дихання везикулярне, жорсткувате, в нижніх відділах з обох сторін одиничні вологі дрібнобулькасті неконсонуючі хрипи. Частота дихання 20 в 1 хвилину, дихання поверхневе. На електрокардіограмі - ознаки гілертро, фії міокарда лівого шлуночка, порушення процесів реполярізації в лівих грудних відведеннях. При ехокардіографічному дослідженні спостерігається збільшення кінцеводіастолічного і кінцевосгстолічного об'ємів лівого шлуночка, помірне зниження його скорочувальних властивостей, потовщення задньої стінки лівого шлуночка та міжшлуночкової перетинки, наявна гіпертрофія міокарда лівого шлуночка (індекс маси міокарда лівого шлуночка 123 г/м3). При рентгенологічному дослідженні в легенях посилений судинний малюнок, корені структурні, тяжисті, більше з правої сторони. При дослідженні очного дна визначається звуження і склерозування артерій, вени повнокровні, поширені, феномен Салюса-Гуна Н-ІІІ ступеня. Дані інших інструментальних та лабораторних досліджень без особливостей. Враховуючи скарги хворого, клінічну картину захворювання, дані об'єктивного дослідження і зважаючи на результати додаткових способів дослідження, хворому був поставлений клінічний діагноз - гіпертонічна хвороба, II стадія. . Враховуючи часту асоціацію порушення функції ендотелію з підвищенням артеріального тиску та з метою оптимізації застосовуємо протигіпертензивної терапії, у хворого був визначений апоптоз ендотеліальних клітин згідно пропонуємого спо-. собу, який склав 28,35%. Через 12 тижнів комплексного лікування, яке включало додаткове застосування лікарських засобів, які мають ендотелій-протекторні властивості, при контрольному обстеженні поряд з поліпшенням клінічної картини захворювання та позитивною динамікою даних інструментальних досліджень, спостерігалося достовірне зменшення апоптозу ендотеліальних клітин, який на кінець курсу терапії склав 18,34%. Таким чином, використання способу, що пропонується, дозволило вчасно визначити ступінь залученості ендотеліальних клітин в патологічне коло патофізіологічних панок захворювання шляхом визначення апоптозу ендотеліальних клітин, призначити патогенетичне зумовлену терапію, що в підсумку призвело до підвищення якості діагностики, дозволило оптимізувати лікування і відвернути появу ускладнень. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122)3-72-89 ( 0 3 1 2 2 ) 2 - 5 7 - 0 3