Індуктор диференціювання in vitro мезенхімальних стовбурових клітин в інсулінпродукуючі клітини

Індуктор диференціювання in vitro мезенхімальних стовбурових клітин в інсулінпродукуючі клітини, що являє собою екстракт, одержаний з тканини підшлункової залози тварин, який відрізняється тим, що екстракт одержаний з підшлункової залози новонароджених поросят. (19) (21) u201012329 (22) 19.10.2010 (24) 10.05.2011 (46) 10.05.2011, Бюл.№ 9, 2011 р. (72) ПЕТРЕНКО ЮРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, МАЗУР СВІТЛАНА ПЕТРІВНА, ГРИЩУК ВІКТОР ПЕТРОВИЧ, ЛЕБЕДИНСЬКИЙ ОЛЕКСАНДР СЕРГІЙОВИЧ, БЛОХ КОНСТАНТІН, IL, ВАРДІ ПНІНА, IL, СКОРОБОГАТОВА НАТАЛІЯ ГРИГОРІВНА, ВОЛКОВА НАТАЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА, ПЕТРЕНКО ОЛЕКСАНДР ЮРІЙОВИЧ 3 чні речовини, які регулюють ріст та диференціювання стовбурових та прогеніторних клітин. Тому такий індуктор здатний забезпечити високий рівень стимуляції диференціювання in vitro МСК в інсулінпродукуючі клітини. Отримання індуктора диференціювання МСК в інсулінпродукуючі клітини з тканини підшлункової залози новонароджених поросят здійснюють таким чином. Тканину підшлункової залози гомогенізують в фізіологічному розчині, отриманий гомогенат центрифугують при 3000 об/хв протягом 10 хвилин при 0°С. Супернатант відділяють та центрифугують при 12000 об/хв протягом 20 хвилин при 0°С, після чого отриманий екстракт фільтрують через мембрановий фільтр із розміром пор 0,22 мкм, розливають порціями по 0,5 мл та зберігають при 80°С до використання. Для порівняння ефективності індукторів диференціювання in vitro МСК людини в інсулінпродукуючі клітини, а саме: екстракту, отриманого з підшлункової залози молодих щурів, яка регенерує, та екстракту з підшлункової залози новонароджених поросят, - проводили паралельне вивчення їхньої дії на МСК людини в культурі. Для цього використовували моношарові культури МСК жирової тканини людини, культивування яких вели до досягнення субконфлуентного моношару в середовищі -МЕМ (Minimum Essential Medium Eagle, alpha modification), доповненому 10% сироватки ембріонів корів, 2 мМ L-глутаміна, 50 од/мл пеніциліна та 50 мкг/мл стрептоміцина, при 37°С в атмосфері 5% СО2 та абсолютній вологості із заміною середовища кожні 3 доби. Індукцію диференціювання МСК в інсулінпродукуючі клітини здійснювали на субконфлуентних моношарових культурах МСК жирової тканини людини. Для цього проводили культивування в стандартному середовищі DMEM/F12 з додаванням 10% сироватки ембріонів корів, 25 мМ глюкози і 10 мМ нікотинаміду у присутності екстракту тканини підшлункової залози молодих щурів та екстракту підшлункової залози новонароджених поросят в кількості 0,2 мг білка/мл протягом 21 доби з заміною середовища кожні 3 доби. Після цього обидві серії клітинних культур піддавали морфофункціональному оцінюванню за допомогою цитологічних, біохімічних та імуноцитохімічних методів. Було з'ясовано, що в обох отриманих серіях культур індуковані клітини гетерогенні, частина з них набула епітеліоподібного вигляду, частина клітин кооперувалася між собою, утворюючи невеликі клітинні групи і кластери. Процес кластерізації проходив більш виразно, із залученням більшої кількості клітин культури, в серіях, де культивуван 59270 4 ня велося у присутності індуктора - екстракту підшлункової залози новонароджених поросят. При цитохімічному забарвленні кластерів та одиничних клітин дітізоном, який є специфічним барвником для інсулінпродукуючих клітин, дітізонпозитивні клітини виявлялися в культурах обох досліджуваних серій, але більше їх спостерігалося в культурах, індукованих за допомогою екстракту підшлункової залози новонароджених поросят. На представлених мікрофотографіях імуноцитохімічної реакції на вміст інсуліну та проінсуліну в культурах МСК, індукованих за допомогою екстракту регенеруючої підшлункової залози молодих щурів (Фіг.1) та екстракту підшлункової залози новонароджених поросят (Фіг.2) видно, що обидва використаних екстракти індукували вступ МСК до диференціювання у гормонпродукуючі клітини наявність зеленого кольору специфічного забарвлення клітин за допомогою моноклональних антитіл на інсулін та проінсулін. Але розподіл індукованих клітин з позитивним зеленим забарвленням серед усіх клітин моношару, що ідентифікувалися по синьому забарвленню ядер клітин ядерним барвником DAPI, розрізнявся. При використанні екстрактів підшлункової залози щурів позитивне забарвлення на гормони виявлялося тільки в зонах високої щільності клітин, а при використанні екстрактів підшлункової залози новонароджених поросят позитивне забарвлення спостерігалось незалежно від клітинної щільності практично по всьому полю препарату. Виконані морфометричні дослідження показали, що відносна кількість гормонпродукуючих клітин на 36% вища в культурі МСК при використанні як індуктора екстракта підшлункової залози новонароджених поросят (Фіг.2). Таким чином, імуноцитохімічний аналіз на вміст інсуліну та проінсуліна в досліджуваних культурах клітин підтвердив перевагу індуктора, що заявляється. Джерела інформації: 1. Timper К., Seboek D., Eberhardt M. et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells differentiate into insulin, somatostatin, and glucagon expressing cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2006; 341. - P. 1135-1140. 2. Choi K.S., Shin J-S., Lee J. et al. In vitro transdifferentiation of rat mesenchymal cells into insulinproducing cells by rat pancreatic extract // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2005. - 330. P. 1299-1305. 3. Lee J., Han D.J., Kim S.C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2008. - 375. - P. 547-551. 5 Комп’ютерна верстка А. Рябко 59270 6 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601