Спосіб індукції апоптозу мононуклеарних клітин периферійної крові

Спосіб індукції апоптозу мононуклеарних клітин периферійної крові, що включає їх виділення, активацію апоптозу та його оцінку, який відрізняється тим, що активацію апоптозу мононуклеарних клітин здійснюють моноклональними антитілами до HLA-A,B,C, HLA- DRTaCD95 молекул, а рівень апоптозу оцінюють застосовуючи забарвлення флуоресцентним та цитологічним барвниками Запропонований винахід відноситься до галузі біологи і медицини і може бути використаний для індукції апоптозу клітин імунної системи Апоптоз це процес, який є різновидом клітинної смерті, і необхідний для підтримання гомеостазу організму, а також обумовлює його нормальне функціонування При атопічних захворюваннях спостерігається інгібування апоптозу лімфоцитів, що може бути однією з причин для протікання хронічного запалення в дихальних шляхах у хворих з атопічною бронхіальною астмою [Vignola AM, Chiappara G, Gaghardo R, Gjomarkaj M, Merendmo A, Siena L, Bousquet J, Bonsignore G Apoptosis and airway inflammation in asthma //Apoptosis 2000 Nov,5(5) 473-85] В той же час відомо, що при алергічних захворюваннях відбувається активація Тп2-клггин і підвищена продукція ЦИТОКІНІВ ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-13, ІЛ-5 сприяє дозріванню еозинофілів і їх активації ІЛ-4/ІЛ-13 індукують В-клітини до синтезу ІдЕ ЗВІДСИ, З імунологічних позицій причиною, якщо не головною, то досить суттєвою, є підвищена активність Тп2клітин Отже, є беззаперечним, що одним із напрямків в імуномодуляцм цих процесів є застосування чинників, які б стимулювали індукцію апоптозу імунокомпетентних клітин, активація яких призводить до розвитку запальних процесів 1)//Аллергология -2002 - № 1 С 13-20], моноклональних антитіл BION-1, які призводять до блокування продукції лімфоцитами запальних цитокінів IL-5, GM-CSF і IL-3 [Ramshaw HS, Woodcock JM, Bagley CJ, McClure BJ, Hercus TR, Lopez AF New approaches m me treatment of asthma // Immunol Cell Biol 2001 Apr, 79(2) 154-9] Найбільш близьким до запропонованого є спосіб індукції апоптозу лімфоцитів з використанням специфічної імунотерапії [Порядин Г В , Салмаси Ж М , Макаров А И Апоптоз лимфоцитов -один из механизмов специфической иммунотерапии атопических заболеваний // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -1998 -Т 125 -№ 4 - С 434-436], за допомогою якого запускається процес апоптозу лімфоцитів, що призводить через деякий час до пригнічення реакції на антиген і зниження синтезу ІдЕ Для здійснення цього способу використовували лімфоцити периферійної крові 12 хворих атонічною формою бронхіальної астми в стадії ремісії, які проходили прискорений курс СІТ в Інституті імунологи Мінздраву Роси Вивчення поверхневих маркерів та морфології клітин крові проводили ДВІЧІ до початку курсу СІТ і відразу після його закінчення Мононуклеарні клітини виділяли з периферійної венозної крові центрифугуванням в одноступеневому градієнті ЩІЛЬНОСТІ фікол-верографіну ВІДОМІ способи індукції апоптозу лімфоцитів за допомогою глюкокортикостероідів [Бойчук С В , Мустафин И Г, Фассахов Р С , Терещенко Д В Спонтанный и глюкокортикоид - индуцированный апоптоз лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой роль митохондрий и CD95 (АРО КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН, експресуючих ВІДПОВІДНІ мем бранні антигени, визначали методом непрямої імунофлуорисценцп з використанням мишачих моноклональних антитіл та Fab-фрагментів козя (О о (О 60629 чих муноглобулінів проти антитіл миші, мічених 2 Спосіб надає можливість реєструвати ізотиоціанатом флуорисцеїну Препарат мікроскоучасть в трансдукції апоптотичного сигналу не піювали у водному імерсійному середовищі Протільки CD95, але і про молекул МНС І і II класу, що водили кількісну оцінку основних популяцій та субнадає нові можливості у розкритті в механізмів + + популяцій лімфоцитів CD3 (Т-лімфоцити), CD4 апоптозу, + (хелперно-індукторні Т-клітини), СВ8 (супресорно3 Імуностимулюючі властивості моноклональ+ цитотоксичні Т-лімфоцити), CD72 (В-лімфоцити), них антитіл та селективність індукованої ними імуКІЛЬКОСТІ лімфоцитів з ранніми ознаками активації ностимуляцм роблять їх безумовно привабливими + + CD25 (рецептор для інтерлейкіну-2), CD71 (редля індукції апоптозу мононуклеарних клітин пе+ цептор для трансферину) та CD23 (низькоафінриферійної крові, ний рецептор для Fc-фрагменту ІдЕ, маркер акти4 Комплексна оцінка процесів апоптозу із завації В-лімфоцитів) Визначали КІЛЬКІСТЬ стосуванням специфічних морфологічних методів + лімфоцитів з ПІЗНІМИ ознаками активації - HLA-DR дослідження апоптозу (фарбування Hoechst 33342 - клітини, а також клітин, "готових" до апоптозу (по та за Май-Грюнвальд-Романовським-Гімза) забезекспресії CD95), КІЛЬКІСТЬ яких збільшувалася піспечує надійність візуальної оцінки процесу ля прийому СІТ Оцінювали наявність і специфічСпосіб виконують наступним чином ність флуоресценції не менше, ніж у 200 клітин В Дослідження проведено у 15 хворих на атопічкожному дослідженні проводили контроль життєну алергію, віком від 16 до 20 років з встановленздатності клітин з трипановим синім (не менше ням позитивної шкірної проби на аероалергени 98%) і неспецифічного зв'язування міченої сирова("Імунолог", м Вінниця) За 72 години до забору тки (не більше 4%) крові хворі припиняли приймати метилоксантини та антипстамінні препарати До контрольної групи Мазки крові готували за загальноприйнятою входило 15 здорових донорів, віком від 16 до 40 методикою, фіксували метанолом, фарбували по років, з негативною шкірною пробою на аероалерРомановському - Гімза Лімфоцити в апоптозі хагени рактеризувались фрагментацією ядра Однак відомий спосіб має ряд недоліків Для виявлення апоптозу МНПК у пацієнтів бралась венозна кров натщесерце 10 мл гепари1 Дослідження апоптозу мононуклеарів перинізованої крові змішували з фосфатносольовим ферійної крові хворих проводились під час стадії буфером (ФСБ) в пропорції 1 1, потім обережно ремісії, що не дозволяє встановити вплив даного нашаровували на градієнт густини фіколу і верогспособу індукції на пригнічення запальних процерафіну (1,077г/мл) і центрифугували (1500 об/хв, сів шляхом апоптозу в період загострення, ЗО хв) Потім суспензію мононуклеарів ДВІЧІ від2 Застосування антигенів (білкових носив) при мивали в ФСБ і визначали КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН В кожСІТ терапії для індукції Т-залежної ВІДПОВІДІ має ній серії ДОСЛІДІВ проводили контроль життєздатпевні особливості Рівень імунної ВІДПОВІДІ на білності клітин з трипановим синім (не менше 98%) ковий носій детермінований в кожного індивіда ІгМНПК 1 - 2 х 106 клітин/мл культивували в середогенами Повторне використання одного носія привищі 199 (институт полиомиелита и вирусных энзведе як до підвищення чутливості, так і до супрецефалитов, РАМН, Москва) з 10% сироватки та см імунної ВІДПОВІДІ А отже ми не можемо говоригентаміпину сульфат (м Харків, ОАО "Фармацевти нро однозначну спрямованість дії СІТ на тична фірма "Здоровье") процеси апоптозу, 3 Експресія CD95 не є обов'язковим критерієм Для стимуляції апоптозу були використані мозапуску процесів апоптозу, а виявляє лише готовноклональні антитіла (мкАТ) анти - HLA — А,В,С, ність клітин до прийняття сигналу через Fas рецеанти - HLA - DR та CD95 (Інститут експериментаптор, льної патологи, онкології і радіобіології їм Кавецького НАН України, Київ) МкАТ вносили у середо4 Для вивчення морфологічних ознак апоптовище культивування у дозі 10 цд на 106 клітин зу був використаний лише один метод Клітинну суспензію культивували в трьох серіях 1 В основу винаходу поставлене завдання ствосерія - 10 % ембріональної сироватки телят, 2 серити спосіб індукції апоптозу мононуклеарних клірія - з 10% аутолопчної сироватки, 3 серія - до тин периферійної крові, шляхом удосконалення МНПК донорів додавали 10 % сироватки хворих на відомого, який дозволяє здійснювати спрямовану атонію, 4 серія - до МНПК хворих ва атонію додаіндукцію апоптозу мононуклеарних клітин перифевали 10% сироватки донорів Культивування здійрійної крові та комплексно оцінювати апоптоз снювали 24 год при 37°С Поставлене завдання вирішують створенням способу індукції апоптозу мононуклеарних клітин З метою комплексної оцінки процесів апоптозу периферійної крові, який згідно винаходу відрізнябули використані забарвлення за методом Майється тим, що активацію апоптозу мононуклеарних Грюнвальд-Романовський-Пмза (цитологічний клітин здійснюють моноклональними антитілами барвник) та Hoecfast 33342 (флуоресцентний бардо HLA-A,B,C, HLA-DR та CD95 молекул, та вклювник) Підраховували МНПК, які мали морфологіччає їх виділення, активацію апоптозу, а комплексні ознаки ранньої стадії апоптозу конденсація та ну оцінку апоптозу проводять застосовуючи забафрагментація хроматину, наявність апоптотичних рвлення флуоресцентним та цитологічним тілець Флуоресценцію реєстрували за допомогою барвниками мікроскопа Люмам Р-8 (Ломо, Росія) Перевагами способу, що заявляється є В експериментальних дослідженнях нами було 1 Дозволяє індукувати апоптоз мононуклеарвстановлено, що у хворих на атонію мононуклеари них клітин периферійної крові на початкових етапериферійної крові мають підвищену чутливість до пах в період загострення захворювання, апоптозу, індукованого зв'язуванням CD95 (Fas/APO-1), HLA-I та HLA-DR молекул Така підвищена чутливість визначається як клітинними факторами, так і дією сироваточних факторів Зокрема, доведено, що зв'язування і блокада клітинних рецепторів МНПК хворих на атопію анти-HLAА,В,С, анти-HLA-DR та CD95 мкАТ може приводити до генерації трансмембранного сигналу, що безпосередньо контролює клітинний ріст і приводить до апоптозу Результати дослідження залежать також і від внесеної в культуру сироватки Сироватка крові хворих на атопію здатна інгібувати апоптоз МНПК донорів, індукований зв'язуванням перелічених молекул (табл 1) Таблиця 1 Морфологічне визначення апоптозу (конденсація хроматину) мононуклеарів периферійної крові (МНПК) хворих атопічною алергією спонтанний (контроль) МНС І -, МНС II -1 CD95 - індукований (фарбування Hoechst 33342) Культивування в присутності мкАТ Умови АнтикультиАнти-HLA HLAСпонтанний CD95 вування -DR А,В,С (контроль) мкАТ МНПК мкАТ мкАТ 10% сироватки 12,2±3,0 14,0±2,86 12,4±2,2 ембріо8,9±2,02 * 1* 2* нів телят 10% аутолопч12,1±5,3 11,2±6,76 11,4±4,71 8,9±2,99 ноі си6 роватки 10% си19,1±2,7 22,7±10,4 20,4±11, роватки 10,4±6,5 * 9* 7* донора Примітка *р