Спосіб модуляції сd95-опосередкованого апоптозу

Спосіб модуляції СО95-опосередкованого апоптозу клітин шляхом інкубації з моноклональними антитілами, який відрізняється тим, що проводять попереднє культивування клітин з антиCDw150 MKAT в концентрації 8-12мкг/мл протягом 20-40 хвилин, а інкубацію після додавання антиCD95 моноклональних антитіл продовжують 3-24 години Винахід відноситься до галузі клітинної біологи і може використовуватись в медицині, а саме в імунорегуляцп патологічних процесів при аутоімунних, лімфопроліферативних та імунодефіцитних захворюваннях Апоптоз є характерною особливістю розвитку багатоклітинних організмів і представляє собою активний процес реалізації програми гибелі клітин В імунній системі апоптоз реалізується в кількох формах внаслідок дії глюкокортикоідів та агентів зі схожою дією, через дефіцит ростових факторів і визваний дисбалансом активаційних сигналів Апоптоз може бути індукований в результаті обробки специфічних поверхневих молекул, таких як CD95 (Fas / APO-1), CD120a (TNFRp60), рецепторних комплексів TCR-CD3, BCR Проте характер ВІДПОВІДІ клітин залежить не від природи сигналів, а від супроводжуючих обставин та особливостей самих клітин Для контролю гомеостазу та ефекторних функцій в імунній системі найбільш часто використовується індукція апоптозу через CD95 / Fas-антиген, який відноситься до суперродини рецепторів фактора некрозу пухлин (TNF) та фактора росту нервів (NGF) CD95 - антиген є транс відбору Крім рецепторів, зв'язаних із запуском CD95 - опосередкованого апоптозу, відомо ряд молекул, що модифікують апоптогений сигнал Для В-лімфоцитів такою рецепторною молекулою є CD40 (Klaus S et al , J Immunology, 1994, vol 152, p5643 - 5652, J Rathmell et al , Cell, 1996, vol 87, p 319 - 329) CD40 - протеїн з мол масою (46) 15 03 2002, Бюл № 3, 2002 р (72) Сидоренко Світлана Павлівна, Шлапацька Лариса Миколаївна, Бердова Ганна Григорівна, Міхалап Світлана Віталіївна (73) Інститут експериментальної патологи, онкологи та радіобіології їм Р Є Кавецького НАН України (56) Klaus S et, J Immunology, 1994, vol 152, мембраним глікопротеїдом з м м 43 - 45KD І екс пресується в тканинах, де може бути постійно, або з'являтись після активації клітин Крім клітин лімфоідного та мієлоїдного походження CD95 знайдено на клітинах тимуса, печінки, серця, легень Відомо, ЩО В ХОДІ онтогенезу клітин імунної системи СО95-опосередкований апоптоз багаторазово виступає в ролі як регулятора загальної КІЛЬКОСТІ популяції клітин, так і в якості фактора О 50KD, ЩО ВІДНОСИТЬСЯ ДО суперродини TNF/NGF Саме спосіб модуляції CD95 - опосередкованого апоптозу через CD40 ми вибрали прототипом нашого винаходу В ході диференційовки CD40 разом з CD95 рецептором можуть викликати процеси, кінцевий результат яких залежить від комбінації та часу отриманих сигналів від Вклітинного рецепторного комплексу (BCR) та корецепторних молекул Зрілі В-клітини в ході кооперації з Тлімфоцитами можуть отримувати як проліферативний, так і апоптозний сигнали В результаті взаємодії толерантних В-клітин з Т-лімфоцитами стимулюється експресія лігандів до CD40 (CD40L) та CD95 (CD95L) на Т-клітинах Подальше сприйняття рецептором CD40 сигнала від CD40L впливає на підвищення рівня експресії CD95 В-клітинами Разом з цим, відсутність повноцінного сигналу при кооперації Т-В-лімфоцитів через BCR не призводить до секреції Т-клітинами ЦИТОКІНІВ, зокрема IL4, які виступають як анти-апоптозний сигнал Саме в разі такої кооперації Т-В-лімфоцитів CD95 - рецептор виступає в ролі професіонального акцептора апоптогених сигналів і здатний приймати сигнали від CD95L+ клітин до розвитку апоптозу В даному випадку дію CD40 та CD95 молекул можна со го 00 44833 та не стимульованої цими МКАТ вже через 3 годирозцінювати як синергічну у відношенні індукції ни Лігація CDw150 спричинює різке підвищення апоптозу Експерименти in vitro на ЛІНІЯХ КЛІТИН числа клітин, що піддались впливу CD95 - опоселюдини та тварин показали, що взаємодія CD40 з редкованого апоптозу Слід зауважити, що МКАТ CD40L, або анти- CD40 МКАТ веде до пригнічу3HTH-CDW150 не впливають не тільки на рівень вання проліферації клітин та їх загибелі [S експресії CD95, але і на рівень спонтанного апопFunakoshi et al , Blood, 1994, vol 83, р 2787 - 2794, тозу Нами показано, що однією із важливих умов, Р Garrone etal , J Exp Med , 1995, vol 182, p 1267 яка дозволяє вирішити поставлену задачу є час - 1273, E Schattnee e t a l , J Exp Med 1995, додавання в культуру МКАТ 3HTH-CDW150 та вибір vol 182, p1557 - 1565, J Wang e t a l , Eur J їх оптимальної концентрації Найкращий модулюImmunology, 1996, vol 26 , p 92 - 96] ючий ефект сигналу через антиген CDw150 на Проте в ряді робіт [Г Rothstein etal , Nature, CD95 - опосередкований апоптоз спостерігається 1995, 374, p 163 - 165, J Rathmell et al , Cell, 1996, в результаті 20 - 40 хвилинної попередньої інкубаvol 87, p319 - 329, L Gahbert e t a l , J Exp Med, ції клітин з МКАТ 3HTH-CDW150 Одночасне вне1996, vol 183, p77 - 85] відмічається, що CD40 сення до клітин МКАТ 3HTH-CDW150 та анти-СО95 може модифікувати апотозний сигнал шляхом затакож впливає на підвищення числа клітин, що хисту зрілих В-лімфоцитів від апоптозу В даному зазнають апоптичних змін в порівнянні з КІЛЬКІСТЮ випадку результатом взаємодії Т-В-лімфоцитів є таких клітин в необроблених 3HTH-CDW150 МКАТ активація Т-клітин через CD28 та експресія ними Проте їх КІЛЬКІСТЬ, в залежності від часу індукції CD40L та CD95L Сигнал через CD28 корецептор апоптозу, на 2 - 15% менша від числа апоптичних відповідальний і за індукцію експресії генів цитокіклітин в культурах, попередньо оброблених антинів, та, ВІДПОВІДНО, захищає активовані ВCDw150 МКАТ МКАТ 3HTH-CDW150 не викликають лімфоцити від дефіциту ростових факторів Таким модулюючого ефекту на CD95 - опосередкований чином, при такій Т-В-клітинній кооперації внаслідок апоптоз в разі їх додавання після анти-СО95 CD40 лігацм В-лімфоцити отримують антиМКАТ апоптозні сигнали і, не дивлячись на індукцію Fas антигену, попереджують розвиток апоптозу Отже, сигнал через CD40 регулює експресію CD95 на поверхні В-лімфоцитів Проте подальша доля клітин може бути двоякою, так як лігація CD40 може мати як синергічний, так і антагоністичний ефект на програму апоптозу Пошук нових молекул та способу модуляції CD95 - опосередкованого апоптозу склало задачу винаходу, що заявляється Поставлена задача вирішується шляхом попереднього культивування клітин з 3HTH-CDW150 МКАТ в концентрації 8 - 12мкг/мл протягом 20 - 40 хвилин з подальшим інкубуванням з анти-СО95 МКАТ протягом 3 - 24 годин В якості 3HTH-CDW150 МКАТ були взяті МКАТ ІПО-3, отримані в 1983 році співробітниками Інституту експериментальної патологи, онкології та радіобіології їм Р Є Кавецького НАН України О П Ветровою та С П Сидоренко (авторське свідотство СРСР № 1389284, МПК С12N 5/00, А61К 30/00, 1987р ) На VI Міжнародній нараді з вивчення Диференційовочних Антигенів Лейкоцитів Людини, що проходила у м Кобе (Японія) у 1996 році, МКАТ ІПО-3 отримали світове визнання Антиген, що розпізнає МКАТ ІПО-3, отримав міжнародну номенклатуру CDw150 (D Mason e t a l , Leucocyte Typing VI, New York, 1997, p 206 - 229, S Sidorenko Leucocyte Typing VI, New York, 1997, p 1212) На СЬОГОДНІШНІЙ день відомо ще лише одне моноклональне антитіло, яке розпізнає антиген CDw150 Антиген CDw150/inO-3 є сіалізованим фосфоглікопротеїдом м м 75 - 96KD З білковим ядром 42KD, ЩО асоційований фосфатазою CD45, фосфошозітол фосфатазою SHIP та тирозин кіназою Fgr Культивування клітин з МКАТ ІПО-3, на відміну від анти-СО40 МКАТ, не впливає на рівень експреси CD95 антигену Проте подальше додавання анти-СО95 МКАТ дає можливість спостерігати різницю в КІЛЬКОСТІ апоптичних клітин в культурі, що зазнала попередньої обробки МКАТ aHTH-CDw150, Концентрація МКАТ 3HTH-CDW150 8 - 12мкг/мл є оптимальною Збільшення концентрації МКАТ ІПО-3 до 20 - 30мкг/мл не викликало суттєвих змін в КІЛЬКОСТІ апоптичних клітин визваних індукцією анти-СО95 МКАТ Модулюючий ефект МКАТ ІПО-3 в дозі 50мкг/мл при CD95 - опосередкованому апоптозі підвищує число клітин з апоптичними змінами на 13 - 18%, проте значні затрати на МКАТ не виправдовують поставлену задачу Суть винаходу полягає в тому, що сигнал через CDw150 антиген модулює CD95 - опосередкований апоптоз, завдяки попередньому культивуванню клітин з 3HTH-CDW150 МКАТ в концентрації 8 - 12мкг/мл протягом 20 - 40 хвилин, а інкубацію після додавання анти-СО95 моноклональних антитіл продовжують 3 - 24 години В якості експериментальної системи були вибрані лінії клітин людини МР-1, RPMI-1788 (В-лімфоцити трансформовані вірусом Епштейна-Барр), Raji, Namalva, CESS (лімфома Беркитта), HPB-ALL (Тгострий лімфобласний лейкоз), які одночасно експресують як CD95, так і CDw150 антигени Модуляцію CD95 - опосередкованого апоптозу проводили в 96-лункових плоскодонних планшетах Загальний об'єм середовища, що містив необхідні МКАТ, складав 200мкл МКАТ МОРС21 (lgG1) служили негативним контролем МКАТ 3HTH-CDW150 та МОРС21 вносили в 96-лункові планшети, після чого добавляли клітини в концентрації 0,5 х 106/мл середовища RPMI-1640, що містить 10% інактивованої ембріональної телячої сироватки, 30мг/мл Lглутамшу, 100мкг/мл гентаміцину Після 20 - 40 хвилинного культивування клітин з МКАТ антиCDw150, добавляли анти-СО95 МКАТ ІПО-4 в оптимальній концентрації 1 мкг/мл на 1 - 72 години МКАТ ІПО-4 отримані співробітниками Інституту експериментальної патологи, онкології та радіобіології їм Р Є Кавецького НАН України С П Сидоренко, О П Ветровою, Г Г Бердовою, Л М Шлапацькою (авторське свідотство СРСР № 1684338, МПК С12N 5/18, 1991 р ) На V Міжнарод 44833 ній нараді з вивчення Диференційовочних Антигенів Лейкоцитів Людини, що відбулась в Бостоні (США) в 1993 році було показано, що МКАТ ІПО-4 разом з трьома іншими МКАТ розпізнають АРО-1 / Fas антиген, який отримав номенклатуру CD95 (М Robertson, J Rits Leucocyte Typing V Boston Oxford University Press 1994, vol 2, p 1142 - 1143) Інкубацію МКАТ з клітинами проводили при 37°С в атмосфері 5% СОг КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН, ЩО вступили в апоптоз, оцінювали по зв'язуванню клітинами анексшу V та Hoechst 33342 на флуоресцентному мікроскопі Axiolab (Zeiss, Німеччина) Детальніше суть способу пояснюють слідуючі приклади Приклад 1 Клітини ЛІНІЇ МР-1 (В-лімфоцити трансформовані вірусом Епштейна-Барр) культивували при стандартних умовах в пластикових флаконах Стерильно зібрані клітини центрифугували при 600д протягом 5 хвилин та ресиспендували в культуральному середовищі в концентрації 0,5 х 106/мл, після чого поміщали в 96-лункові планшети з попередньо нанесиними МКАТ МОРС21 (0,2 мкг/мл), aHTH-CDw150 МКАТ ІПО-3 (Юмкг/мл), анти-СО40 МКАТ G28-5 (1 мкг/мл) Через ЗО хвилин добавляли анти-СО95 МКАТ ІПО-4 (1 мкг/мл) Для з'ясування, через який час після лігацм CD95 проявляється модуляція апоптозу через CDw150, інкубацію клітин з анти-СО95 МКАТ проводили протягом 1, 2, 3, 4, 6, 24, 48, 72 годин при 37С° в атмосфері 5%СО2 Для підрахунку КІЛЬКОСТІ КЛІТИН, що зазнали апоптичних змін, використовували фарбування клітин аннексіном V-ФІТС (Annexm V-FITC, Clonteck, США) Аннексш V має здатність зв'язуватись з фосфатиділ-серином, який виходить з цитоплазматичної сторони клітинної мембрани на поверхню клітин уже через 2 години після ініціації запрограмованої смерті клітин При фарбуванні клітин аннексіном V-ФІТЦ, клітини відмивали в HEPES буфері та ресуспендували 50мкл розчину аннексіна V-ФІТЦ з кінцевою концентрацією 0,2мкг/мл Препарати витримували Юхв при кімнатній температурі, ДВІЧІ відмивали шляхом центрифугування при 1500об/хв та поміщали у 50% розчин гліцерину з 4% параформальдегідом на HEPES-буфері Оцінку результатів проводили на флуоресцентному мікроскопі Axiolab (Zeiss, Німеччина) Результати В контрольних культурах число клітин, що зазнали апоптичних змін не перевищувало 2 - 3% (таблиця 1 ) Таблиця 1 Модуляція СО95-опосередкованого апоптозу за допомогою 3HTH-CDW150 МКАТ ІПО-3 (% апоптичних клітин) Умови культивування МР-1+МОРС21 МР-1 +середовище MP-1+aHTH-CDw150 МР-1+анти-СО40 1 2 7 6 4 Час інкубування клітин з анти-СО95 2 3 4 6 2 2 2 2 13 15 18 28 11 23 29 41 8 9 10 18 Синергічний ефект 3HTH-CDW150 МКАТ з апоптозним сигналом через CD95 спостерігається через 3 години після інкубації клітин МР-1 з МКАТ ІПО-4 Такий характер модуляції апоптозу через CDw150 досягає максимуму через 24 години, після додавання анти-СО95 МКАТ ІПО-4 і залишається практично на тому ж самому рівні до 72 годин АнTH-CD40 МКАТ не впливають на підвищення числа апоптичних клітин і мають антагоністичний ефект на програму апоптозу Приклад 2 Стерильно зібрані клітини МР-1 центрифугували при 600д протягом 5 хвилин та ресиспендували в культуральному середовищі в концентрації 0,5 х 106/мл, після чого поміщали в 96-лункові планшети з попередньо нанесиними МКАТ МОРС21 (0,2мкг/мл) та aHTH-CDw150 МКАТ ІПО-3 в концентрації 1 мкг/мл, 7мкг/мл, 8мкг/мл, Юмкг/мл, 12мкг/мл, 15мкг/мл, 20мкг/мл, 30мкг/мл, 50мкг/мл МКАТ, година 24 48 3 3 50 57 72 76 37 37 72 3 56 71 36 Через 40 хвилин добавляли анти-СО95 МКАТ ІПО-4 (1 мкг/мл) Інкубацію клітин МР-1 з МКАТ ІПО-4 проводили протягом 24 годин при 37С° в атмосфері 5%СО2 Для підрахунку КІЛЬКОСТІ КЛІТИН, що зазнали апоптичних змін, використовували фарбування клітин аннексіном V-ФІТС (Annexm VFITC, Clonteck, США) Для цього клітини відмивали в HEPES буфері та ресуспендували в розчині аннексіна V-ФІТЦ з кінцевою концентрацією 0,2мкг/мл Препарати витримували Юхв при кімнатній температурі, ДВІЧІ відмивали шляхом центрифугування при 1500об/хв та поміщали у 50% розчин гліцерину з 4% параформальдегідом на HEPES-буфері Оцінку результатів проводили на флуоресцентному мікроскопі Axiolab (Zeiss, Німеччина) Результати В контрольних культурах число клітин, що зазнали апоптичних змін не перевищувало 2-3% (таблиця 2) 44833 Таблиця 2 Дозова залежність 3HTH-CDW150 моноклональних антитіл ІПО-3 на модуляцію CD95 - опосередкованого апоптозу (% апоптичних клітин) Дози анти-СО\л/150 МКАТ ІПО-3 (мкг/мл) Умови культивування 1 2 53 МР-1 +середовище МР-1+анти-СО95 7 2 61 Результати досліджень чітко показують, що 3HTH-CDW150 МКАТ ІПО-3 в дозах 8 - 12мкг/мл є найефективнішими при модуляції CD95 - опосередкованого апоптозу Ефект від впливу антиCDw150 МКАТ на модуляцію CD95 - опосередкованого апоптозу при дозах менших 8 мкг/мл незначний Очевидно, що збільшення КІЛЬКОСТІ антиCDw150 МКАТ понад 12мкг/мл недоречно, так як значні затрати на МКАТ не виправдовують поставлену задачу Приклад З Клітини ЛІНІЇ МР-1 культивували при стандартних умовах в пластикових флаконах Зібрані та відцентрифуговані при бООд протягом 5 хвилин клітини ресиспендували в культуральному середовищі в концентрації 0,5 х 106/мл, після чого поміщали в 96-лункові планшети з попередньо нанесеними МКАТ МОРС21 (0,2мкг/мл), aHTH-CDw150 МКАТ ІПО-3 (Юмкг/мл) AHTH-CD95 МКАТ ІПО-4 (1 мкг/мл) додавали через 0, 10, 15, 20, 25, ЗО, 35, 40, 45, 50, 60 хвилин культивування клітин з МКАТ 3HTH-CDW150 Інкубацію клітин з анти-СО95 МКАТ проводили протягом 24 годин при 37С° в атмосфері 5%СО2 Для підрахунку КІЛЬКОСТІ КЛІТИН, ЩО зазнали апоптичних змін, використовували фарбування клітин аннексіном V-ФІТС (Annexm V-FITC, 8 2 70 10 3 72 12 2 73 15 3 73 20 2 ЗО 2 76 74 50 2 80 Clonteck, США) При фарбуванні клітин аннексіном V-ФІТЦ, клітини відмивали в HEPES буфері та ресуспендували 50мкл розчину аннексіна V-ФІТЦ з кінцевою концентрацією 0,2мкг/мл Препарати витримували Юхв при кімнатній температурі, ДВІЧІ відмивали шляхом центрифугування при 1500об/хв та поміщали у 50% розчин гліцерину з 4% параформальдегідом на HEPES-буфері Оцінку результатів проводили на флуоресцентному мікроскопі Axiolab (Zeiss, Німеччина) Результати В контрольних культурах число клітин, що зазнали апоптичних змін не перевищувало 2 - 3% (таблиця 3) В результаті проведених експериментів очевидно, що суттєвим моментом при модуляції CD95 - опосередкованого апоптозу є час внесення в культуру клітин 3HTH-CDW150 МКАТ Одночасне внесення до клітин МКАТ антиCDw150 та анти-СО95 впливає на підвищення числа клітин, що зазнають апоптичних змін в порівнянні з КІЛЬКІСТЮ таких клітин в необроблених анTH-CDW150 МКАТ Проте, найкращий модулюючий ефект сигналу через антиген CDw150 на CD95 опосередкований апоптоз спостерігається в результаті 20 - 40 хвилинної попередньої інкубації клітин з MKATaHTH-CDw150 Таблиця З Вплив попереднього культивування клітин з 3HTH-CDW150 МКАТ ІПО-3 на модуляція CD95 - опосередкованого апоптозу (% апоптичних клітин) Умови культивування МР-1 +середовище МР-1+анти-СО95 Приклад 4 ЛІНІЯ КЛІТИН Час культивування клітин з 3HTH-CDW150 МКАТ, хв 0 2 62ч НРБ-ALL 10 2 64 15 3 67 має Т клітинне походження і одночасно експресує антигени CD95 та CDw150 Стерильно зібрані клітини HPB-ALL центрифугували при бООд протягом 5 хвилин та ресиспендували в культуральному середовищі в концентрації 0,5 х 106/мл, після чого поміщали в 96-лункові планшети з попередньо нанесеними МКАТ МОРС21 (0,2мкг/мл) та антиCDw150 МКАТ ІПО-3 в концентрації 8мкг/мл Через ЗО хвилин добавляли анти-СО95 МКАТ ІПО-4 (1 мкг/мл) Інкубацію клітин НРБ-ALL з МКАТ ІПО-4 проводили протягом 24 годин при 37С° в атмосфері 5%СОг Для підрахунку КІЛЬКОСТІ КЛІТИН, ЩО зазнали модулюючий ефект 3HTH-CD95W1 50 МКАТ ІПО-3 на CD95 - опосередкований апоптоз вивчали після 24 годин інкубації клітин з анти-СО95 МКАТ ІПО-4 Підраховування апоптичних клітин проводили шляхом фарбування клітин Hoechst 20 2 70 25 3 72 ЗО 3 72 35 2 71 40 2 73 45 2 72 50 3 73 60 2 71 33342 (Sigma, США), який зв'язується з ДНК у місцях розривів Цей метод виявляє апоптичні клітини через 4 - 6 годин після того, як клітини отримали апоптичний сигнал Перед фарбуванням Hoechst 33342 зібрані клітини ДВІЧІ відмивали в забуфероному фізіологічному розчині (ЗФР) та в ЗФР з 0,1% сироватковим альбуміном биків (БСА), після чого клітини ресиспендували в 50мкл розчина ЗФР з 0,1% БСА, що містив 0,1 мкг/мл Hoechst 33342 Препарати шкубували ЗОхв при 37°С, ДВІЧІ відмивали шляхом центрифугування при 1500об/хв та заключали в 50% гліцерин з 4% параформальдегідом у ЗФР Результат КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН НРБ-ALL, що під дались впливу CD95 - опосередкованого апоптозу через 24 години складала 48% В культурі клітин, що одночасно культивували з 3HTH-CDW150 та анти-СО95 МКАТ, число апоптичних клітин стано 44833 10 вило 62% Таким чином, анти-СО\л/150 МКАТ ІПО-3 модуляції апоптозу лімфоцитів, що мають Твпливають на модуляцію CD95 - опосередкованого клітине походження апоптозу лімфоцитів, що мають Т-клітинне похоПри розгляді питання часу проведення експедження, в результаті чого зростає число апоптичрименту з модуляції CD95 - опосередкованого них клітин апотозу із застосуванням анти-СО40 МКАТ слід зауважити, що для індукції CD95/Fas-aHTnreHy за З наведених прикладів зрозуміло, що сигнали допомогою анти-СО40 МКАТ необхідно 48 - 72 через CDw150 та CD40 антигени відрізняють за години Лише після цього клітини підлягають обхарактером ВІДПОВІДІ на індукцію CD95 - опосередробці анти-СО95 МКАТ При використанні антикованого апоптозу Перевага застосування антиCDw150 МКАТ достатньо 20 - 40 хвилинного попеCDwl150 МКАТ в модуляції CD95 - опосередковареднього культивування клітин з цими МКАТ, щоб ного апоптозу доведена при паралельному вивизвати синергічний ефект у відношенні індукції вченні дії 3HTH-CDW150 та анти-С040 МКАТ на CD95 - опосередкованого апоптозу ЛІНІЯХ клітин різного походження Дію CDW150 та CD95 антигенів можна розцінювати як синергічну у Таким чином, ми встановили, що відношені індукції апоптозу, тоді як анти-С040 CDw150/inO3 є новим антигеном, що модулює МКАТ можуть інгібувати апоптознии сигнал АнтиCD95 - опосередкований апоптоз лімфоцитів люген CDw150 є маркером активованих В- та Тдини та визначили умови модуляції Спосіб, що лімфоцитів, що дає можливість використовувати заявляється, може бути використано при імуноре3HTH-CDW150 МКАТ при модуляції апоптозу цих гуляцм патологічних процесів при захворюваннях клітин В той же час CD40 антиген не експресовасистем крові та лімфоідної тканини і відкриє нові ний на Т-лімфоцитах, що виключає його роль у підходи до імунотерапії цих захворювань ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90