Спосіб прямої регенерації мікропагонів з листкових експлантів actinidia deliciosa (chev.) liang, ferguson в культурі in vitro

УКРАЇНА (19) U A (11)61018 (із) А (51)7 А01Н4/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД видається під відповідальність власника патенту (54) СПОСІБ ПРЯМОЇ РЕГЕНЕРАЦІЇ МІКРОПАГОНІВ З ЛИСТКОВИХ ЕКСПЛАНТІВ ACTINIDIA DELICIOSA (CHEV.) LIANG, FERGUSON В КУЛЬТУРІ IN VITRO (21)20021210668 (22)27 12 2002 (24)15 10 2003 (46) 15 10 2003, Бюл № 10, 2003 р (72) Митрофанова Ірина Вячеславівна, Іванова Наталія Миколаївна (73) НІКІТСЬКИЙ БОТАНІЧНИЙ САД НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР листкових експлантів Actimdia dehciosa (Chev) Liang, Ferguson в культурі in vitro, що включає ви Винахід відноситься до біотехнологм одержання посадкового матеріалу цінних видів рослин, що трудно розмножуються Відомий спосіб прямої регенерації з тканини листка на прикладі хурми [Долгов С В Разработка методов регенерации и генетической трансформации хурмы (Diospyros kaki) // Новые методы биотехнологии II Российский симпозиум, г Пущино, 18 - 20 мая 1993 г Тез докл - Пущино, 1993 С 17] Листкові ДИСКИ поміщають на живильне середовище Мурасіге і Скуга (1962) з додаванням 1,5мг/л зеатину, 0,Змг/л шдолілмасляної кислоти (ІМК), 0,5мг/л пбереїлової кислоти, органічних компонентів та антиоксидантів Частота регенерації перевищує 50% на протязі 4-х МІСЯЦІВ Даний спосіб регенерації може бути застосований лише для листкових експлантів хурми, і не дає результатів при розмножуванні Actimdia dehciosa в культурі in vitro Відомий спосіб прямої регенерації мікропагонів з тканин листка Actimdia chinensis Planch, в культурі in vitro [Spasenoski M , Neskovic M In vitro vegetative propagation ofActimdia chinensis Planch, from juvenile and adult plant segments // Bulleten de L'lnstitut et du jardm bot De Puniversite de Beorgad 1985 - XIX - P7-13] Листкові експланти поміщають на живильне середовище, що містить макро- і мікроелементи за прописом Мурасіге і Скуга (МС), вітаміни, а також 4,4мкМ бензиламшопурину (БАП), 0,29мкМ пбереїлової кислоти і 0,43мкМ шдолілмасляної кислоти Регенерація мікропагонів проходить через етап калюсоутво лучення експлантів з листя рослин, одержаних в умовах in vitro, культивування висічок листка на живильному середовищі, що містить половинну концентрацію макро- і мікросолей, вітаміни за Мурасіге і Скуга, який відрізняється тим, що в живильне середовище як фітогормони одночасно уводять бензиламшопурин (1,0-3,0мг/л) і ІНДОЛІЛОцтову кислоту (0,8-2,0мг/л), а листкові експланти розміщують адаксіальною поверхнею до живильного середовища рення При цьому індекс проліферації досягає 1 4 Даний спосіб розроблено з урахуванням видових особливостей A chinensis Наявність проміжного етапу калюсоутворення приводить до епігенетичних і генетичних змін рослин Окрім того, при такому способі розмноження індекс проліферації досить низький Відомий спосіб прямої регенерації мікропагонів з тканин листка на прикладі Actimdia kolomicta [Фирсов А П , Степанова В И , Долгов С В Разработка методов регенерации и генетической трансформации A kolomicta II Новые методы биотехнологии II Российский симпозиум, г Пущине, 18-20 мая 1993г Тез докл -Пущине, 1993 -С 56] (прототип), в якому листкові диски A kolomicta, взяті від рослин вирощених в культурі in vitro, поміщають на живильне середовище МС, що містить 22,61 мкМ зеатину Частота регенерації складає 75-80% Регенерація проходить через калюсну фазу тривалістю 4-6 тижнів Індекс проліферації складає 1 6 Спосіб розроблено для рослин A kolomicta з урахуванням особливостей виду Наявність проміжної калюсної фази приводить до генетичної неоднорідності одержаних мікропагонів В основу винаходу поставлено завдання удосконалити спосіб прямої регенерації мікропагонів A dehciosa в умовах in vitro за рахунок підбору в живильному середовищі фітогормонів з метою максимального виходу генетичне однорідного рослинного матеріалу 00 о (О 61018 Поставлене завдання розв'язується тим, що листкові експланти A dehciosa, взяті від рослин, вирощених в культурі in vitro, поміщають на живильне середовище, що містить половинну концентрацію макро - і мікросолей, вітаміни за прописом МС, згідно з винаходом довповнене фітогормонами - БАП та ІНДОЛІЛОЦТОВОІ кислоти (ЮК) лення при нагріванні і перемішуванні Обидва розчини зливають, ретельно перемішують, розливають по культуральних посудинах, закривають накривками з фольги і автоклавують при 0,8-1 атм 15 20 хвилин Склад живильного середовища на основі МС, (мг/л) рН 5,6-5,8 1 Амоній азотнокислий 700-1000 2 Калій азотнокислий 850-1100 3 Кальцій хлористий 200-240 4 Магній сірчанокислий 170-200 5 Калій фосфорнокислий двозамінний 70-90 6 Натрій етилендіамін тетраацетат 17-20 7 Залізо сірчанокисле 12-15 8 Борна кислота 2,8-3,4 9 Марганець сірчанокислий 10,5-12,0 10 Цинк сірчанокислий 3,9-4,5 11 Калій йодистий 0,35-0,44 12 Натрій молібденовокислий 0,10-0,18 13 Мідьсірчанокисла 0,009-0,018 14 Кобальт хлористий 0,009-0,018 15 Тиамш-НСІ 0,09-0,20 16 Піридоксин-НСІ 0,35-0,60 17 Нікотинова кислота 0,40-0,60 18 Мезошозит 90-110 19 Бензиламшопурин (БАП) 1,0-3,0 20 Індолилоцтова кислота 0,8-2,0 21 Сахароза 25000-30000 22 Агар 6000-7500 На одержане живильне середовище поміщають листкові диски А dehciosa діаметром 1см, взяті від рослин, які вирощені в культурі in vitro Експланти поміщають адаксиальною і абаксиальною поверхнею до живильного середовища Експланти культивують при температурі 25°С, 16-годинному фотоперіоді та інтенсивності освітлення 2-Зклк Через 4 тижні перебування листкових експлантів на живильному середовищі формуються адвентивні бруньки і мікропагони Інтенсивність пагоноутворення збільшується через 8 тижнів культивування Вибір концентрацій фітогормонів для індукції пагоноутворення безпосередньо з тканин листка обґрунтовується даними таблиці 1 При цьому лискові експланти розміщують адаксиальною поверхнею до живильного середовища В разі використання в живильному середовищі тільки одного фітогормона БАП на листкових дисках формувався калюс, який пізніше не проходив етап диференціації, що не дало змогу одержати мікропагони A dehciosa в умовах in vitro В іншому випадку, при наявності в живильному середовищі як фітогормоно ЮК утворювалися не мікропагони, а формувався калюс, з якого потім утворювалися коренеподібні структури Одночасне комплексне застосування БАП і ЮК в живильному середовищі дали змогу одержати максимальну КІЛЬКІСТЬ мікропагонів A dehciosa в культурі in vitro - через чотири тижні після уведення листкового експланта на живильне середовище Інтенсивність пагоноутворення збільшилася через 8 тижнів культивування, індекс проліферації досягав 1 10 Мікропагони в умовах in vitro регенерували без проміжної калюсної фази, що забезпечило їх генетичну стабільність Розміщення листкових експлантів на поверхні живильного середовища також впливало на частоту регенерації і КІЛЬКІСТЬ мікропагонів, що утворилися Найбільший вихід мікропагонів A dehciosa в культурі in vitro у ВІДПОВІДНОСТІ з винаходом досягнуть при адаксиальному розміщенні листкових експлантів на поверхні живильного середовища у порівнянні з абаксиальним Пропонований спосіб здійснюється таким чином готується живильне середовище В бідистильованій воді розчиняють макроелементи і мікроелементи в половинній концентрації згідно з прописом МС У розчин додають вітаміни, БАП і ЮК, далі розчиняють сахарозу, бідистильованою водою доводять КІЛЬКІСТЬ розчину до потрібного об'ємуі з допомогою рН метра доводять необхідну кислотність до 5,7 Окремо розчиняють наважку агару - 6,5г/л і добиваються його повного розтоп Таблиця 1 Вплив концентрацій БАП і ЮК на КІЛЬКІСТЬ мікропагонів A dehciosa в культурі in vitro, що утворилися Концентрація БАП і ЮК, мг/л 1,0+1,0 2,0+1,0 2,0+1,5 2,0+2,0 3,0+3,0 5,0+5,0 10,0+10,0 КІЛЬКІСТЬ ЛИСТКОВИХ ДИСКІВ, ЩО утворюють мікропагони, % 4 тижні 10,0+2,1 28,0+2,4 50,0+4,1 35,0+2,5 25,0+0,5 10,0+0,8 Регенерація мікропагонів A dehciosa в умовах in vitro відбувалася як при низьких, так і при високих концентраціях фітогормонів, але з мінімальною частотою Експерименти показали, що 2,0мг/л БАП 0 8 тижнів 27,0+1,8 60,0+5,7 90,0+8,5 80,0+6,5 40,0+5,2 25,0 + 20,0+2,3 і 1,5мг/л ЮК були оптимальними концентраціями для прямого адвентивного пагоноутворення В присутності 2,0мг/л БАП і 1,0мг/л ЮК, а також 2,0мг/л БАП і 2,0мг/л ЮК КІЛЬКІСТЬ ЛИСТКОВИХ 61018 5 дисків, що утворюють мікропагони досягала 60 і 80% ВІДПОВІДНО Подальше збільшення концентрацій приводило до утворення калюсу 2-х типів компактного і крихкого, що знижувало частоту регенерації адвентивних мікропагонів Встановлено, що адаксиальне розміщення експлантів на живильному середовищі в порівнян ні з абаксиальним збільшувало частоту регенерації мікропагонів до 85% і забезпечувало максимальний вихід мікропагонів в культурі in vitro Вплив орієнтації листкових дисків A dehciosa на живильному середовищі на пагоноутворення підтверджено даними таблиці 2 Таблиця 2 Вплив орієнтації листкових дисків на живильному середовищі на регенераційну здатність у A Dehciosa Розміщення листкових КІЛЬКІСТЬ ЛИСТКОВИХ ДИСКІВ, ЩО утворю- КІЛЬКІСТЬ мікропагонів / КІЛЬКІСТЬ ЛИСТдисків на живильному сереють мікропагони, % КОВИХ ДИСКІВ, шт довищі 4 тижні 8 тижнів 4 тижні 8 тижнів Абаксиально 45,0±2,3 55,0±2,4 4,0±0,1 6,3±0,1 Адаксиально 50,0±4,2 100,0±0,0 4,7±0,3 11,0±0,5 З даних таблиці випливає, що КІЛЬКІСТЬ проліферуючих експлантів через 8 тижнів культивування досягла 100% Індекс проліферації досягав 1 1 0 від первинного експланта Адвентивні мікропагони Комп'ютерна верстка Н Лисенко регенеували без проміжної калюсної фази, що надалі забезпечувало генетичну стабільність одержаних мікропагонів A dehciosa Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119