Спосіб гістобактеріоскопічного дослідження кишки

Спосіб гістобактеріоскопічного дослідження кишки, який включає взяття тканини, іммобілізацію пристінкового слизового шару тканини за допомогою гелю, фіксацію тканини в розчині формаліну, 3 ни шлунку, іммобілізацію слизового шару шляхом занурення в попередньо підігрітий 1% розчин агарозного гелю, фіксацію тканини у 10% розчині формаліну, зневоднення у спирті, просвітлення в ксилолі, просочування парафіном, заливку тканини в парафінові блоки, виготовлення зрізів з блоку на мікротомі, забарвлення зрізів, підрахунок кількості бактерій та їх видову ідентифікацію. Ознаками, спільними з прототипом, є: - взяття тканини; - іммобілізація пристінкового слизового шару тканини за допомогою гелю; - фіксація тканини в розчині формаліну; - зневоднення в спиртах; - просвітлення в ксилолі; - просочування парафіном; - заливка тканини в парафінові блоки; - виготовлення з блоків мікротомних зрізів; - депарафінування зрізів; - забарвлення зрізів тканини; - видова ідентифікація бактерій; - підрахунок їх кількості. Недоліками цього способу є: використання підігрітого агарозного гелю для іммобілізації слизового шару тканини, що не дозволяє зберегти тонку цитологічну структуру клітин кишки, тому що менш ніж через 15 хвилин після зупинки кровообігу починається аутоліз тканин кишки під дією травних ферментів, а також відбувається дегрануляція клітин кишки. В основу способу поставлено задачу розробити спосіб гістобактеріоскопічного дослідження кишки, який шляхом іммобілізації пристінкового слизового шару кишки гелем, до складу якого входить фіксатор, дозволяє уникнути дегрануляції та лізису клітин кишки що дозволяє проводити ідентифікацію бактерій у слизовому шарі кишки, підраховувати їх кількість та досліджувати взаємозв'язок між станом клітин кишки та бактеріальною флорою шляхом цитохімічного аналізу клітин кишки. Суттєвими ознаками способу є: - взяття тканини кишки; - іммобілізація пристінкового слизового шару тканини шляхом наповнення кишки охолодженим гелем, до складу якого входить нейтральний формалін; - фіксація тканини в охолодженому розчині нейтрального формаліну; - зневоднення в спиртах; - просвітлення в ксилолі; - просочування парафіном; - заливка тканини кишки в парафінові блоки; - виготовлення з блоків мікротомних зрізів; - депарафінування зрізів; - забарвлення зрізів кишки; - видова ідентифікація бактерій; - підрахунок їх кількості; - цитохімічне дослідження клітин кишки. Відмінними від аналогу ознаками способу є: - іммобілізація слизового шару кишки шляхом наповнення її порожнини охолодженим гелем, до складу якого входить нейтральний формалін; 61047 4 - фіксація тканини охолодженим розчином нейтрального формаліну; - цитохімічне дослідження клітин кишки. Спосіб здійснюють таким чином: здійснюють взяття ділянки кишки, порожнину якої наповнюють охолодженим до 4-8°С гелем, до складу якого входить фіксатор - нейтральний формалін, потім тканину фіксують в охолодженому до 4-8°С 10 % розчині нейтрального формаліну впродовж 48-52 годин, зневоднюють у спиртах, просвітлюють у ксилолі, просочують парафіном, заливають у парафінові блоки, з яких роблять мікротомні зрізи, які депарафінують та забарвлюють фарбником, проводять видову ідентифікацію і підрахунок бактерій та цитохімічний аналіз клітин кишки. Спосіб дозволяє не тільки зберегти асоційовану із пристінковим слизовим шаром мікрофлору, а й запобігти швидкому аутолізу та дегрануляції клітин кишки завдяки використанню охолодженого гелю, до складу якого входить нейтральний формалін, для іммобілізації пристінкового слизового шару та фіксації тканини в охолодженому фіксаторі. Приклад конкретного виконання: відразу після аутопсії порожнину відділу кишки довжиною 10 мм за допомогою шприца заповнювали охолодженим до 4°С гелем, який містив води дистильованої стерильної - 90 мл, нейтрального формаліну 10 мл, желатину - 15 г, потім фіксували протягом 48 годин у 10% нейтральному формаліні при 4°С. Фіксовану тканину без промивання переносили для зневоднення у 96° спирт на 1 годину, потім остаточно зневоднювали в абсолютному спирті (дворазово, по 1 годині) просвітлювали в ксилолі (дворазово по 30 хвилин), просочували в суміші парафіну та ксилолу при 37°С, протягом 30 хв, у чистому парафіні при 56°С (дворазово по 1,5 год) та заливали в парафін, з парафінових блоків на ротаційному мікротомі виготовляли зрізи товщиною 2 мкм, які наклеювали на предметні скельця та висушували при кімнатній температурі протягом 24 год, депарафінували у ксилолі (дворазово по 5 хв), та забарвлювали гематоксилін-флоксином, для чого зрізи попередньо доводили крізь спирти (100°, 90°, 96°, 80°, 70°) до води, на забарвлених зрізах ідентифікували бактерії та підраховували їх кількість, а також кількість гранул в клітинах Панета клубової кишки за допомогою мікроскопа (збільшення 1500), на основі підрахунку кількості гранул в 100 клітинах та бактерій у слизовому шарі 100 кишкових ворсинок розраховували середню арифметичну, похибку середньої арифметичної; порівняння вибірок проводили за допомогою tкритерію. Для оцінки заявленого способу гістобактеріоскопічного дослідження кишки проводили дослідження гранул клітин Панета клубової кишки та вмісту бактерій в її слизовому шарі. Дослідження проводили на 27 безпородних здорових неінфікованих щурах, вагою 193±29 г. Результати досліджень наведено у таблиці. 5 61047 6 Таблиця   Кількість гранул у клітинах Панета та бактерій у слизовому шарі клубової кишки X  m Група тварин Кількість тварин Кількість гранул Контроль Голодування Прийом їжі, інфікованої Е. соlі 7 10 10 49,2±1,33 65,5±1,70* 12,7±0,81* Кількість бактерії у слизовому шарі 1,8±0,04 1,3±0,03* 9,6±0,04* *р