Спосіб одержання препарата для профілактики і лікування шлунково-кишкових захворювань сільськогосподарських тварин

Изобретение относится к биотехнологии, в частности касается получения сухого бациллярного препарата субтилис, используемого для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных. Цель изобретения - повышение качества и выхода целевого продукта, увеличение срока его хранения. Для получения препарата используют штамм бактерий Bacillus subtilis 44-Р. Штамм отобран среди штаммов, выделенных из содержимого рубца крупного рогатого скота, по культурально-морфологическим признакам, отсутствию токсичности и патогенности для лабораторных и домашних животных при применении внутрь и парентеральном введении, способности к глубинному росту. Штамм Bacillus subtilis 44-P депонирован в Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер В-4099. Штамм Bacillus subtilis ВКПМ № В-4099 характеризуется следующими свойствами. Культурально-морфологические особенности штамма. Грамположительные спорообразующие палочки с закругленными концами, подвижные. На агаризованной картофельно-минеральной среде при температуре 37°С выращивания колонии через 18-20ч роста слизистые, блестящие, округлой формы, возвышенные, через 24-48ч роста складчатые, матовые с приподнятым центром и зазубренными краями, бесцветные или беловатого цвета, На поверхности жидких сред образует тонкую пленку, под пленкой столбик среды прозрачный, обладает способностью к глубинному росту. Ферментирует глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит. Активно продуцирует каталазу, ацетилметилкарбинол. При сбраживании углеводов накапливает до 95% молочной кислоты. Гидролизует крахмал. Отношение к фагам, лизирующим клетки других штаммов того же вида микроорганизмов. Фагоустойчивый. Генетические особенности (ауксотрофность, устойчивость к антибиотикам и т.д.). Ауксотрофностью не обладает, устойчив к мономицину и стрептомицину, чувствителен к левомицетину и тетрациклину. Условия и состав сред для хранения штамма. В лиофильно высушенном виде или на агаризованной среде при температуре 3 - 5°С. Состав среды: 20%-ный картофельный отвар 1л; (NH4)2HPO4 5,0г; K2НРO 4 2,0г; MgSO4 0,1г; агар-агар 20,0г. Способ приготовления картофельного отвара. Для отвара используют тщательно промытый неочищенный картофель, режут ломтиками величиной 2-3см и варят до готовности. Отвар фильтруют в остывшем виде через 4 слоя марли и вносят остальные компоненты согласно прописи. рН среды доводят до 7,0-7,2, стерилизуют 30мин при 1кгс/см 2. Условия и состав сред для размножения штамма. Выращивание в колбах при температуре 37°С в течение 5-8 сут. на среде такого состава, г: Кукур узный экстракт 20 Меласса 20 Крахмал 5 Аммоний фосфорнокислый трехзамещенный 5 Калий фосфорнокислый двухзамещенный 2 Магний сернокислый 0,1 Вода водопроводная, мл 1000 Условия и состав сред для ферментации. Выращивание в ферментерах с перемешиванием и аэрацией при температуре 37°С в течение 36ч на жидкой питательной среде. Максимальная и средняя активности (продуктивности) штамма, а также производственные показатели штамма. В 1г сухого бациллярного препарата субтилис содержится не менее 5 млрд. жизнеспособных клеток. Способ определения активности (продуктивности) штамма с указанием метода. Чашечный метод. Метод основан на приготовлении ряда последовательных разведении 1г препарата в стерильной водопроводной воде с высевом в агаризованные среды с крахмалом в чашки Петри, с последующим подсчетом выросших колоний. Типичность выросших колоний штамма определяют по культурально-морфологическим признакам и йодной пробой. При внесении капли йодного раствора колонии дают бесцветную зону. Приготовление йодного раствора. В 100мл воды растворяют 20г йодистого калия, 10г йода. Для реакции раствор разбавляют в 5 раз водой. Пример 1. 100л питательной среды готовят и стерилизуют дробно: Одна часть, мас.%: Вода хозпитьевая 40,0 СаСО3 0,06 a-амилаза 0,15 Крахмал картофельный или кукурузный 15,0 При температуре 75°С ± 2 и перемешивании проводят гидролиз крахмала. После окончания гидролиза крахмала добавляют, мас.%: K2SО4 0,5 MgSO4 0,03 NaCl 0,06 Другая часть, мас.%: Вода хозпитьевая 40,0 БВК 0,4 (NH4)2НРО4 1,5 Кукур узный экстракт 2,0 Части соединяют и корректировку рН проводят 20%-ным стерильным раствором NaOH до значения 6,6-6,8. Биохимические показатели приготовленной питательной среды: Сухие вещества по Балингу, ° 11-13 рН 6,6-6,8 Глюкоза, % 3,5-4 Азот аминный, мг/% 25 - 30 Затем вносят 0,01% к объему среды, взвесь чистой культуры В. subtilis ВКПМ № В-4099. Культивирование ведут лубинно в течение 28ч при температуре 37°С±1, непрерывном перемешивании и аэрации стерильным воздухом с расходом 0,1 V/V. Титр клеток составляет 2,4 х 109 кл/мл. Бактериальную массу отделяют от нативного раствора суперцентрифугированием при 12600 g (15000 об/мин). Полученную влажную биомассу смешивают в соотношении 1:1 с защитной средой состава, мас.%: Сахароза 5-10 Натрий уксуснокислый 1-2 Вода хозпитьевая Остальное Полученную пасту высушивают сублимационно. Выход 495г сухого продукта с титром жизнеспособных клеток В. subtills ВКПМ № В-4099 42 х 10 9 кл/г, что соответствует выходу целевого продукта 8,7% от культуральной жидкости (табл. 1). В табл. 1 приведены усредненные результаты по трем сериям опытов. Из данных табл. 1 видно, что при получении биомассы препарата предлагаемым способом значительно интенсивней идет накопление количества клеток в культуральной жидкости, повышается выход жизнеспособных клеток после высушивания сырой биомассы с наполнителем, и в 2-3 раза увеличивается их со хранность при хранении в течение 12-15 месяцев . Пример 2. Влияние количественного соотношения компонентов среды определяют по титру жизнеспособных клеток в культуральной жидкости. Культивирование проводят глубинно при температуре 37°С±1 в течение 28ч, перемешивании и аэрации 0,1 V/V. Данные приведены в табл. 2. Из данных табл. 2 видно, что снижение количества (меньше чем в варианте 1) компонентов среды ведет к уменьшению выхода жизнеспособных клеток, это отразится на количестве конечного продукта, а при их увеличении (больше, чем в варианте 3) отмечен незначительный рост числа клеток, хотя расход таких ценных компонентов среды, как крахмал, БВК и кукурузный экстракт резко увеличивается, что способствует удорожанию препарата. Пример 3. При подготовке микробных клеток к лиофилизации было изучено влияние защитной среды, состоящей из сахарозы и натрия уксуснокислого в различных концентрациях (табл. 3). Из приведенных в табл. 3 данных видно, что снижение количества сахарозы и натрия уксуснокислого меньше чем в 1 варианте приведет к снижению титра жизнеспособных клеток в готовом препарате, что наблюдается и при их увеличении больше чем в 3 варианте. Выход жизнеспособных клеток без применения защитной среды ниже почти в 2 раза. Пример 4. Было изучено влияние различных количеств подаваемого в ферментер воздуха для аэрации (0,08, 0,1, 0,2, 0,4 объемов среды) на выход жизнеспособных клеток в культуральной жидкости, что показано в табл. 4. Как видно из представленных в табл. 4 данных, оптимальным количеством подаваемого воздуха в ферментер при накоплении биомассы В. subtilis ВКПМ В-4099 является 0,1 объем воздуха на объем питательной среды в течение всего периода выращивания. Повышение его количества снижает выход жизнеспособных клеток в культуральной жидкости. Таким образом, способ позволяет повысить качество и выход готового продукта, увеличить срок хранения и снизить себестоимость препарата. Таблица 1 Сравнительная эффективность известного и предлагаемого способа получения сухого бациллярного препарата Титр жизнеспособных клеток Выход Полученный в готового в сухом сухой препарат культуральной препарате, продукта, % жидкости, кл/г кл/мл По известному 0,3*108 1*109 6,8 способу По 2,4*109 42*109 8,7 предлагаемому способу Сохранность жизнеспособных клеток Bacillus subtilis БКПМ В-4099 6 мес. 9 мес. 12 мес. 15 мес. 100 56,8 47,4 23,6 100 51,3 84,7 66,9 Таблица 2 Влияние количественного соотношения компонентов среды на накопление биомассы бациллярного препарата субтилис в культуральной жидкости Компоненты среды, показатель Крахмал картофельный или кукурузный a-амилаза БВК Кукур узный экстракт Калий сернокислый Аммоний фосфорнокислый двузамещенный Магний сернокислый СаСО3 NaCl Вода Количество жизнеспособных клеток в 1мл культуральной жидкости Количественное соотношение компонентов среды, %, значение показателя, вариант 1 2 3 4 10,0 12,0 15,0 17,0 0,1 0,12 0,15 0,17 0,2 0,3 0,4 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0,2 0,4 0,5 0,6 1,0 1,3 1,5 1,7 0,01 0,02 0,03 0,04 0,02 0,04 0,06 0,08 0,02 0,04 0,06 0,08 Остальное 2,0*109 2,2*109 2,4*109 2,5*109 Таблица 3 Влияние различных количеств компонентов защитной среды на выход жизнеспособных клеток в лиолизированном бациллярном препарате Количественное соотношение компонентов защитной среды, %, значение показателя, вариант Компоненты защитной среды, показатель Контроль без 1 2 3 внесения защитной среды Сахароза 5,0 10,0 15,0 Натрий уксуснокислый 1,0 2,0 3,0 Вода 94,0 88,0 82,0 Выход жизнеспособных клеток 38*109 42*109 41*109 24*109 бациллярного препарата после лиофилизации в 1г Таблица 4 Влияние количества подаваемого в ферментер воздуха на вы ход жизнеспособных клеток Bacillus subtilis, шт. 44-Р в культуральной жидкости Количество воздуха подаваемого в ферментер, объемов на объем Время культивирования, ч среды в час 0,08 28 0,10 28 0,20 28 0,40 28 Количество клеток в 1 см 3 культуральной жидкости 2,1*109 2,4*109 2,0*109 1,6*109