Спосіб визначення гемолітичної активності комплементу морської свинки

Спосіб визначення гемолітичної активності комплементу морської свинки, що включає поєднання зростаючих доз комплементу зависі еритроцитів барана, гемолізину, розчинника, витримування суміші на водяній бані за 37 °С - 38 °С упродовж 10 хвилин, обліку ступеня гемолізу еритроцитів і визначення мінімальної гемолітичної дози комплементу (титру), який відрізняється тим, що завись відмитих еритроцитів крові барана попередньо поєднують з гемолізином, а потім комплекс гемолізин + еритроцити вносять у пробірки з комплементом. (19) (21) u201011060 (22) 14.09.2010 (24) 25.07.2011 (46) 25.07.2011, Бюл.№ 14, 2011 р. (72) БАБКІН АНАТОЛІЙ ФЕДОРОВИЧ, СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, ВОВК СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ, ГАДЗЕВИЧ ДМИТРО ВІКТОРОВИЧ, БЛИЗНЕЦОВ ОЛЕКСІЙ ГЕНАДІЙОВИЧ (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" 3 4 - гемолітичну сироватку крові кроля (гемолізин) у подвійному або потрійному титрі в об'ємі 0,2 мл; 5 - розчинник в об'ємі 0,4 мл (замість антигену і сироватки). Це рішення може бути прототипом. Недоліком прототипу є те, що компоненти індикаторної системи (еритроцити барана і гемолізин) вносять у пробірки окремо, що уповільнює швидкість реакції і термін 10 хвилин є недостатнім для точного визначення кількісних показників активності комплементу. Регламентування мінімальної дози активності комплементу 0,12 у розведенні 1:20 для визначення придатності біопрепарату не дає можливості використання деяких серій комплементу з меншою активністю. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб визначення гемолітичної активності комплементу морської свинки, що включає поєднання зростаючих доз комплементу зависі еритроцитів барана, гемолізину, розчинника, витримування суміші на водяній бані за температури 37 °C - 38 °C упродовж 10 хвилин, облік ступеню гемолізу еритроцитів і визначення мінімальної гемолітичної дози комплементу (титру) шляхом попереднього поєднання зависі відмитих еритроцитів крові барана з гемолізином, внесення комплексу гемолізин + еритроцити у пробірки з комплементом, щоб забезпечити більш точне визначення активності комплементу за рахунок створення оптимальних умов дії комплементу на імунний комплекс еритроцити - гемолізин. Запропонований спосіб відрізняється тим, що визначається більш точно мінімальний титр комплементу, а відповідно і кількість доз (одиниць) гемолітичної активності в одному мл біопрепарату, що відповідає критерію "новизна" Спосіб виконується таким чином: Спочатку окремо готують індикаторну систему у необхідній кількості. 1.- проводять сенсибілізацію зависі еритроцитів барана гемолізином, шляхом поєднання рівних об'ємів (3,0 мл + 3,0 мл) 2,5 % або 3 % еритроцитів та гемолізину у подвійному або потрійному титрі і витримування суміші при кімнатній температурі 25 °C або у термостаті 37-38 °C впродовж 10 хвилин; 2. - у пробірки вносять зростаючі дози комплементу з інтервалом 0,02 мл (від 0,02; 0,04; 0,06… до 0,18) у розведенні 1:20; 3. - розчинник (0,85 %-вий розчин NaCl) в різних дозах від 0,18; 0,16; 0,14 до 0,02 (загальний об'єм різних доз комплементу з розчинником 0,2 мл); 4 - індикаторну систему гемолізин + еритроцити вносять в об'ємі 0,4 мл у пробірки з різними дозами комплементу; 61391 4 5 - у всі пробірки вносять розчинник 0,4 мл (замість антигену і сироватки). Штатив з пробірками ставлять на водяну баню на 10 хвилин за температури 37-38 °C і проводять облік реакції. Мінімальний титр комплементу у гемолітичній системі у розведенні 1:20 або 1:10 повинен бути менше 0,12 мл. У випадках коли мінімальна доза комплементу у розведенні 1:20 становить більше регламентованої дози - 0,12 (тобто 0,14; 0,16 і вище) проводять повторне титрування зазначеної серії комплементу у розведенні 1:10, щоб забезпечити більш точне визначення мінімального титру комплементу, що спричиняє повний гемоліз. Приклад 1 Було проведено дослідження гемолітичної активності чотирьох серій ліофілізованого комплементу в РЗК. Реакцію ставили об'ємі 1,0 мл по 0,2 мл кожного компоненту. Облік реакції проводили візуально за ступенем гемолізу після витримування суміші компонентів за температури 37 °C впродовж 10 хвилин. У перший спосіб (прототип), всі компоненти реакції, зокрема, суспензію еритроцитів і гемолізин вносили окремо по 0,2 мл. У другий спосіб (корисна модель), 2,5 % суспензію еритроцитів і гемолізин в подвійному титрі (1:750), попередньо поєднували у однакових об'ємах для сенсибілізації еритроцитів впродовж 10 хвилин і вносили у всі пробірки по 0,4 мл. Результати наведені в таблиці 1 свідчать, що сенсибілізовані еритроцити були більш чутливі до комплементу. Повний гемоліз еритроцитів спричиняла менша доза комплементу. Мінімальний титр комплементу із сенсибілізованими еритроцитами був на 2-3 розведення меншим у порівнянні з прототипом. Приклад 2 Було проведено порівняльний аналіз результатів виявлення гемолітичної активності за титром комплементу, за визначенням однієї гемолітичної дози активності і кількості гемолітичних доз в одному мл комерційних серій комплементу. Отримані результати підтверджують більшу ефективність запропонованого способу у порівнянні з прототипом, що має також важливе значення у комерційних відносинах між виробником і споживачем біологічного препарату (Табл. 2). Таким чином, запропонований спосіб визначення гемолітичної активності комплементу морської свинки з використанням сенсибілізованих еритроцитів майже вдвічі підвищує чутливість реакції і визначення гемолітичної дози комплементу у порівнянні з прототипом, що підтверджує практичне значення запропонованого способу, зокрема, визначення кількості доз (одиниць) гемолітичної активності в одному мл комерційної серії комплементу. 5 61391 6 Таблиця 1 Спосіб визначення гемолітичної активності комплементу морської свинки № разка 1 2 3 4 Зразки комплементу і спосіб постановки РЗК Комплемент Прототип 2008 рік 1:10 кор.модель серія 1 Комплемент прототип 2006 рік 1:20 кор.модель серія 1 Комплемент прототип 2008 рік 1:20 кор.модель серія 8 Комплемент прототип 2009 рік 1:20 кор.модель серія 1 Дози комплементу 0,08 0,1 0,12 0,14 0,02 0,04 0,06 0,16 0,18 0,2 НГ ЧГ ЧГ ЧГ ПГ ПГ ПГ ПГ ПГ ПГ ЧГ ЧГ ПГ ПГ ПГ ПГ ПГ ПГ ПГ ПГ НГ ЧГ ЧГ ЧГ ЧГ ЧГ ПГ ПГ ПГ ПГ НГ НГ ЧГ ПГ ПГ ПГ ПГ ПГ ПГ ПГ НГ НГ НГ ЧГ ЧГ ПГ ПГ ПГ ПГ ПГ НГ ЧГ НГ НГ НГ НГ НГ НГ НГ НГ НГ НГ ЧГ ЧГ НГ НГ ПГ ПГ ПГ ПГ НГ НГ ЧГ НГ НГ НГ ПГ ПГ ПГ ПГ Позначення: НГ- немає гемолізу, ЧГ - частковий гемоліз, ПГ - повний гемоліз. Таблиця 2 Спосіб визначення гемолітичної активності комплементу морської свинки Кількість нативного комТитр розведеного Кількість гемоліплементу у одиниці ге№ зраз- Зразки комплементу і спосіб пос- комплементу (одитичних доз в 1 мл молітичної активності ка тановки РЗК ниця гемолітичної комерційної серії (одна гемолітична доза), активності), мл комплементу мл 0,1 0,005 200 Комплемент 2008 прототип 1 рік серія 8,1:20 Кор.модель 0,04 0,002 500 0,08 0,004 250 Комплемент 2009 прототип 2 рік серія 1,1:20 Кор.модель 0,06 0,003 333 0,08 0,008 125 Комплемент 2008 прототип 3 рік серія 1,1:10 Кор.модель 0,04 0,004 250 0,12 0,006 167 Комплемент 2006 прототип 4 рік серія 1,1:20 Кор.модель 0,06 0,003 333 Комп’ютерна верстка М. Ломалова Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601