Спосіб визначення біомолекул шляхом комплексоутворення зі специфічними імуноглобулінами
Номер патенту: 61564
Опубліковано: 25.07.2011
Автори: Коваленко Олексій Григорович, Болтовець Прасковія Миколаївна, Поліщук Олена Миколаївна, Снопок Борис Анатолійович
Формула / Реферат
Спосіб визначення біомолекул шляхом комплексоутворення зі специфічним імуноглобуліном, що включає модифікацію поверхні чутливого елемента сенсора поверхнево-плазмового резонансу (ППР), іммобілізацію на модифікованій поверхні рецепторного білка, вимірювання величини сигналу ППР, нанесення специфічного для досліджуваних біомолекул імуноглобуліну на поверхню сенсора з іммобілізованим рецепторним білком, додавання досліджуваного зразка, вимірювання величини зміни сигналу ППР, по якій судять про наявність у зразку досліджуваних біомолекул, який відрізняється тим, що модифікацію поверхні чутливого елемента здійснюють розчином тіоціанату концентрації 10-2-10-4М, на поверхні іммобілізують рецепторний білок A Staphylococcus aureus концентрації 20-50 мкг/мл, а досліджуваний зразок перед нанесенням на модифіковану поверхню сенсора попередньо змішують зі специфічним імуноглобуліном.
Текст
Спосіб визначення біомолекул шляхом комплексоутворення зі специфічним імуноглобуліном, що включає модифікацію поверхні чутливого елемента сенсора поверхнево-плазмового резонансу (ППР), іммобілізацію на модифікованій поверхні 3 зміру (менше 10 кДа), а також складні багатокомпонентні суміші. Це звужує область застосування прототипу. Задачею корисної моделі є розширення області застосування методу поверхневого плазмового резонансу для більш складних багатокомпонентних сумішей, зокрема сумішей вірусів зі специфічними імуноглобулінами і молекулами невеликого розміру, що потенційно можуть мати антивірусний ефект, елементи яких можуть впливати один на одного, зокрема таких, компоненти яких істотно відрізняються між собою за молекулярною масою при суттєвому підвищенні експресності способу. Поставлена задача вирішується тим, що здійснюють модифікацію поверхні чутливого елемента ППР сенсора, іммобілізацію на модифікованій поверхні рецепторного білка, вимірювання величини сигналу ППР, нанесення специфічного для досліджуваних біомолекул імуноглобуліну на поверхню сенсора з іммобілізованим рецепторним білком, додавання досліджуваного зразка, вимірювання величини зміни сигналу ППР, по якій судять про наявність у зразку досліджуваних біомолекул. Модифікацію поверхні чутливого елемента здійсню-2 -4 ють розчином тіоціанату концентрації 10 -10 М, на поверхні іммобілізують білок A Staphylococcus aurens концентрації 20-50 мкг/мл, а досліджуваний зразок перед нанесенням на модифіковану поверхню сенсора попередньо змішують зі специфічним імуноглобуліном. На Фіг. 1, де на осі абсцис позначено співвідношення специфічного імуноглобуліну і досліджуваного зразка, на осі ординат – відгук ППР, схематично зображено характерні особливості поверхневих комплексів різного складу за відсутності - структури b, c, d, і наявності - структури b", с", d" в системі додаткового чинника, здатного частково блокувати взаємодію між специфічним імуноглобуліном і досліджуваним зразком. За відсутності молекул імуноглобуліну у досліджуваному розчині і у випадку, коли молекули зразка не взаємодіють з поверхнею, на поверхні відсутні будь-які структури (а), зміни сигналу ППР нема. Наявність невеликої кількості імуноглобуліну приводить до утворення структур типу (б), коли всього декілька молекул імуноглобуліну взаємодіють з поверхнею молекули зразка, що приводить до формування на поверхні структур малої щільності, оскільки загальна кількість молекул імуноглобуліну значно менша, ніж необхідно для максимально можливого покриття, спостерігається незначна зміна сигналу ППР. Збільшення співвідношення імуноглобулін/зразок приводить до зростання щільності структури при збереженні товщини і упаковки комплексів у поверхневій структурі аж до повного заповнення усіх можливих місць адсорбції молекул імуноглобуліну (в), зміна сигналу ППР сягає максимуму. Подальше збільшення співвідношення імуноглобулін/зразок призводить до конкуренції вільних молекул імуноглобуліну і комплексів імуноглобулін/зразок за місця зв'язування на поверхні (д) і, відповідно, зменшення величини зміни сигналу ППР аж до значення, характерного для поверхні, вкритої лише молекулами імуноглобулІну без молекул зразку. Таким чи 61564 4 ном, в координатах відгук ППРімуноглобулін/зразок повинен спостерігатись максимум, що відповідає найбільш щільно упакованій структурі на поверхні чутливого елемента. Для багатокомпонентної суміші, що включає в себе не лише молекули зразка та молекули імуноглобуліну, а й і молекули невеликого розміру, які потенційно можуть мати антивірусний ефект, зокрема частково блокувати рецепторні центри, що може впливати на щільність утворюваної структури, а отже і на величину зміни сигналу ППР (Фіг.1 структури b", с", d"), використання саме такого підходу є доцільним. ПРИКЛАД. Як приклад конкретного виконання способу, що заявляється, розглянемо визначення вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ) шляхом комплексоутворення зі специфічним імуноглобуліном за умов його попередньої обробки полісахаридом глюкуроноксиломананом (GXM), що потенційно може мати антивірусний ефект за відсутності такої обробки. Вірус (100 мкг/мл), білок А (50 мкг/мл) та імуноглобулін (розведення від 1:25 до 1:1600) розчинялися у фосфатному буфері (PBS), ОХМ (300 -2 мхг/мл) та тіоціанат калію (KNCS) (10 М) - у воді. Дослідження проводилися за допомогою скануючого SPR спектрометра "BioHelper-01" [4]. Скляні пластинки 20 × 20 × 1mm з тонким (45-55 нм) шаром золота, нанесеним через адгезивний шар хрому (2нм), фіксувалися на підтримуючій скляній призмі за допомогою імерсійної рідини (поліфеніловий ефір), показник заломлення якої близький до показника заломлення скла (1,61) [5]. Попереднє змішування компонентів досліджуваної суміші здійснювалась за кімнатної температури (~+20°), вірус витримували з GXM протягом півгодини, після чого суміш змішували зі специфічним імуноглобуліном, і витримували ще півгодини. Виміри здійснювались в проточному режимі, швидкість протоку складала 50 мкл/хв. Загальний хід експерименту представлено на Фіг.2, де на осі абсцис позначено час вимірювання (Time, s), на осі ординат - відгук ППР (steps). Обробка поверхні сумішшю НСІ/H2O2/H2O (15/15/70 об'єму) для видалення можливих органічних забруднювачів здійснювалась безпосередньо перед експериментом, модифікацію поверхні чутливого елемента здійснювали розчином тіоціанату калію концентрації 10 2 М. Після промивання поверхні сенсора буфером на поверхні іммобілізували білок А Staphylococcus aureus концентрації 50 мкг/мл, після чого - досліджуваний зразок, попередньо змішаний зі специфічним імуноглобуліном. За різницею у величині зміни сигналу ППР при наявності у суміші GXM і за його відсутності робили висновок про його вплив на утворення комплексу між вірусом та імуноглобулінами. Було показано, що оскільки для зразків вірусу, що попередньо витримувались з GXM, величини зміни сигналу ППР були меншими, ніж для тих, що не були піддані такій обробці, обробка вірусу глюкуроноксиломананом зменшує його здатність взаємодіяти зі специфічними імуноглобулінами в широкому діапазоні концентрацій специфічних імуноглобулінів. 5 61564 Завдяки нанесенню на поверхню сенсора комплексу, утвореного досліджуваним зразком і специфічним імуноглобуліном, експресність способу істотно збільшується. Таким чином, технічне рішення, що заявляється, повністю вирішує поставлену задачу. 1. Homola j, Surface Plasmon Resonance Sensors for Detection of Chemical and Biological Species, Chem. Rev., 108 (2008), 462-493. 2. Lee HJ, Yan Y, Marriott G, Corn RM. Quantitative functional analysis of protein complexes on surfaces. J Physiol. 2005 Feb 15; 563 (Pt 1):61-71 3. Liedberg В., Lundström I., Stenberg E. Principles of biosensing with an extended coupling Комп’ютерна верстка Л. Купенко 6 matrix and surface plasmon resonance // Sensors and Actuators B.-1993.-11. - P.63-72 4. В. Snopok, M. Yurchenko, L. Szekely, G. Klein, E. Kasuba "SPR based immuno-capture approach for in vitro analysis of protein complex formation:mapping of MRS18-2 binding site on retinoblastoma protein", Anal. Bioanal Chem.386,2063-2073 (2006). 5. G.V. Beketov, Yu.M.Shirshov, O.V.Shynkarenko, V.LChegel ''Surface piasmon resonance spectroscopy:prospects of superstate refractive index variation for separate extraction of molecular layer parameters" Sensors and Actuators B.48,432-438 (1998). Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for determination of bio-molecules through complex formation with specific immunoglobulins
Автори англійськоюBoltovets Praskovia Mykolaivna, Polischuk Olena Mykolaivna, Kovalenko Oleksii Hryhorovych, Snopok Borys Anatoliiovych
Назва патенту російськоюСпособ определения биомолекул путем комплексообразования со специфическими иммуноглобулинами
Автори російськоюБолтовец Прасковья Николаевна, Полищук Елена Николаевна, Коваленко Алексей Григорьевич, Снопок Борис Анатольевич
МПК / Мітки
МПК: G01N 35/00
Мітки: комплексоутворення, визначення, спосіб, специфічними, імуноглобулінами, біомолекул, шляхом
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/3-61564-sposib-viznachennya-biomolekul-shlyakhom-kompleksoutvorennya-zi-specifichnimi-imunoglobulinami.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб визначення біомолекул шляхом комплексоутворення зі специфічними імуноглобулінами</a>
Попередній патент: Шліфувальний круг
Наступний патент: Спосіб автоматичного керування процесом зневоднення та гранулювання у псевдозрідженому шарі
Випадковий патент: Спосіб моделювання абдомінального сепсису