Спосіб детектування та визначення концентрації біомолекул та молекулярних комплексів та пристрій для його здійснення

1 Спосіб детеїсгування та визначення концентрації бюмолекул та молекулярних комплексів, що включає опромінення межі поділу оптично більш щільного середовища, що має показник заломлення п1, з оптично менш щільним середовищем, що має показник заломлення п2, які задовольняють умові п1 більше п2, р-поляризованою електромагнітною хвилею, переважно видимого діапазону хвиль, з боку оптично більш щільного середовища, реєстрацію відбитого від межі поділу випромінювання та його аналіз, який відрізняється тим, що опромінення межі поділу проводять, використовуючи набір кутів падіння р-поляризованої електромагнітної хвилі, реєструють інтенсивність відбитої від межі поділу електромагнітної хвилі для всього набору кутів падіння і проводять детектування, визначення концентрації бюмолекул, молекулярних комплексів та визначення маси шару бюмолекул та молекулярних комплексів, адсорбованого на вказаній межі шляхом математичної обробки даних вимірів за спеціально розробленим алгоритмом 2 Пристрій для детектування та визначення концентрації бюмолекул та молекулярних комплексів, який містить прозорий оптичний елемент з оптично більш щільної речовини, межу поділу з оптично менш щільною речовиною, електропровідну або напівпровідникову плівку на вказаній межі, джерело випромінювання, розташоване з боку більш щільного середовища, блок керування призмою та фоточутливий елемент, який відрізняється тим, що прозорий оптичний елемент виконаний в вигляді призми, кут біля основи якої дорівнює 90° 3 Пристрій по п 2, який відрізняється тим, що другий кут біля основи призми вибирається рівним куту поверхневого плазмонного резонансу для даного показника заломлення призми, речовини електропровідної плівки і даного показника заломлення зовнішнього середовища, плюс-мінус 5 % О 00 О (О Технічне рішення, що заявляється, відноситься до області аналітичної техніки для ХІМІЧНОГО та біохімічного аналізу і може бути використане для експресного та високочутливого детектування і визначення концентрації різних речовин в газообразному та рідкому середовищі, проведення біохімічних, аналізів та імунологічних тестів в КЛІНІЧНІЙ практиці та з метою досліджень, в бютехнологм, для контролю якості істивних продуктів, сільськогосподарської сировини та питної води, в тому числі для визначення рівня змісту шкідливих речовин (пестицидів, гербіцидів, інсектицидів, фунгіцидів, дефоліантів, сивушних масел і т п), а також для екологічного моніторингу навколишнього се редовища ВІДОМІ спосіб та пристрій для детектування та визначення концентрації бюмолекул і молекулярних комплексів в рідкій речовині, що аналізується, по заявці PN GB2247749 МКИ G01N-021-75, від 10 06 1993р , які базуються на явищі поверхневого плазмонного резонансу (див L С Laycock, S С Webster Bio sensor utilizing surface plasmon resonance PN GB2247749, IP G01N-021-75, UPAB 10 06 1993, PA Gee-Marconi Ltd) Спосіб включає опромінення межі поділу між скляною призмою (оптично більш щільне середовище) і досліджуваним розчином (оптично менш щільне середовище) з боку більш щільного сере 46018 падіння При цьому можливі помилки, обумовлені впливом різних перешкоджаючих факторів, наприклад, зміною показника заломлення середовища, що аналізується Ці помилки важко виявити на стадії вимірювань, що знижує надійність та достовірність одержаної інформації В якості прототипу був вибраний спосіб детектування та визначення концентрації біомолекул та молекулярних комплексів та пристрій для його здійснення, описаний в заявці AM Z 92510239, МКИ G01N021-55, від 12 01 1994р, які базуються на явищі поверхневого плазмонного резонансу Вони використовувались для детектування та визначення концентрації молекул дезоксирибонуклеїнової кислоти, які прямо чи опосереднено адсорбуються, осаджуються або зв'язуються за рахунок фізичних чи ХІМІЧНИХ взаємодій з поверхнею поділу між оптично більш щільним середовищем та оптично менш щільним середовищем Поверхня поділу містить тонку електропровідну або напівпровідникову плівку, переважно металеву Спосіб включає опромінення межі поділу оптично більш щільного середовища та оптично менш щільного середовища електромагнітною хвилею переважно видимого діапазону під кутом падіння, що відповідає поверхневому плазмонному резонансу (поверхнева плазмонна хвиля заставляє молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти відбивати або генерувати світло в ВІДПОВІДЬ на неї), вимірювання інтенсивності електромагнітної хвилі, відбитої від межі поділу При цьому інтенсивність відбитої хвилі весь час утримується в мінімумі, що відповідає куту плазмонного резонансу ВІДОМІ спосіб та пристрій для детектування та Пристрій для здійснення цього способу місвизначення концентрації біомолекул та молекулятить межу поділу між оптично більш щільним серних комплексів в рідкій речовині, що аналізується редовищем (скляна призма) і оптично менш щільпо заявці PN WQ93-06463 МКИ G01N021-55, від ним (досліджуваний розчин), оснащений електро12 011994г, публікація Optical Sensor, провідною або напівпровідниковою плівкою, переS J Peacock, H С Jaggers, J S Shaw важно металевою, джерело р-поляризованого електромагнітного випромінювання переважно Спосіб включає опромінення межі поділу між видимого діапазону хвиль, розташоване так, щоб скляною призмою (оптично більш щільне середовипромінювання падало на межу поділу з боку вище) і досліджуваним розчином (оптично менш оптично більш щільного середовища, приймач щільне середовище) з боку більш щільного серевипромінювання пристрій повороту призми віднодовища, вимірювання випромінювання, відбитого сно джерела випромінювання для постійного підвід шару, в якому збуджується поверхневий плазтримування інтенсивності відбитого світла монний резонанс, детектування та визначення концентрації речовини, що аналізується, по ЗМІНІ Недоліком способу-прототипу є те, що детекінтенсивності відбитого світла при фіксованому тування та визначення концентрації речовини, що куті падіння аналізується, проводиться непрямим методом і не дає безпосередньої кількісної міри цієї речовини, Пристрій для здійснення цього способу містить адсорбованої на поверхні чутливого елементу шар речовини, в якій збуджується поверхневий Крім цього, мінімум резонансної кривої має деяку плазмонний резонанс, межу поділу між оптично ширину (порядку (2° - 3°)) В зв'язку з цим, якщо більш щільним середовищем та оптично менш адсорбція на поверхню чутливого елементу речощільним середовищем, джерело світла необхідної вини, що аналізується, приведе до зміщення мінідовжини хвилі, пристрій сканування, який сканує муму резонансної кривої на величину менше припромінь світла поблизу вибраного кута падіння, веденої (Д0), присутність в пробі речовини, що систему лінз, яка направляє промінь на вибране аналізується, може бути не виявлена (фіг 1) Тому місце поверхні, детектор, який вимірює інтенсивцей спосіб містить помилки, обумовлені різними ність світла, відбитого від цього місця перешкоджаючими факторами, наприклад, зміною Вищезгадані ВІДОМІ технічні рішення для детепоказника заломлення розчину ктування та визначення концентрацій біомолекул та молекулярних комплексів використовують обТаким чином, аналіз відомих способів детектумежену КІЛЬКІСТЬ експериментальних даних - зміну вання та визначення концентрації біомолекул покута поверхневого плазмонного резонансу або казує, що вони всі не забезпечували необхідну інтенсивності відбитого світла при постійному куті достовірність одержуваної інформації довища, вимір вихідного сигналу детектору як функції часу, яка однозначно зв'язана з кутовим положенням скануючого променя, реєстрацію інтенсивності відбитого від межі поділу випромінювання в залежності від кута падіння електромагнітної хвилі на поверхню скляної призми Форма кривої плазмонного резонансу, і зокрема, положення мінімуму, залежить від показника заломлення призми, оптичних констант та товщини шару, в якому збуджується поверхневий плазмонний резонанс по відношенню до падаючого та відбитого випромінювання та від оптичних параметрів і товщини шару молекул, які знаходяться на або поблизу зовнішньої поверхні плівки Про наявність біомолекул та молекулярних комплексів судять за величиною зміщення кута поверхневого плазмонного резонансу в присутності речовини, що аналізується Пристрій для здійснення цього способу містить шар речовини, в якому збуджується поверхневий плазмонний резонанс, межу поділу між оптично більш щільним середовищем та оптично менш щільним середовищем, джерело світла необхідної довжини хвилі, пристрій сканування, який сканує промінь світла поблизу вибраного кута падіння, систему лінз, яка направляє промінь на вибране місце поверхні, детектор, який вимірює інтенсивність світла, відбитого від цього місця Пристрій сканування може являти собою голографічний елемент, що обертається, багатогранну дзеркальну призму або кубічний дефлектор, що обертається, причому в КІНЦІ кожного циклу сканування генерується імпульс за допомогою пристрою, що кодує положення валу 46018 ливу поверхню сенсора та детектуванню пестициду в досліджуваному розчині Запропонований спосіб детектування та визначення концентрації бюмолекул та молекулярних комплексів на основі поверхневого плазмонного резонансу, забезпечує кількісне вимірювання маси речовини, що аналізується, присутньої на чутливій площадці пристрою Чутлива площадка виконана в виді електропровідної плівки визначеної товщини, яка знаходиться на межі поділу двох середовищ з показниками заломлення п1 та п2, причому пі > п2 Визначення маси речовини, що аналізується, виконується шляхом опромінення вказаної межі поділу р-поляризованою електромагнітною хвилею зі сторони оптично більш щільного середовища (п1), вимірювання інтенсивності відбитої хвилі при декількох різних кутах падіння та математичної обробки даних вимірів для всіх кутів падіння по спеціально розробленому алгоритму Принципи детектування та визначення концентрації адсорбованих молекул на основі явища Для здійснення способу використовують приповерхневого плазмонного резонансу (ППР), тобто стрій, який включає прозорий оптичний елемент з збудження коливань електронів провідності (повеоптично більш щільної речовини, межу поділу з рхневих плазмонів, поверхневих поляритонів чи оптично менш щільною речовиною, електропровіповерхневих плазмон-поляритонів) в тонкій електдну або напівпровідникову плівку на цій межі, блок ропровідній ПЛІВЦІ за допомогою електромагнітної керування призмою та фоточутливий елемент (світлової) хвилі розглядаються в статі Прозорий оптичний елемент цього пристрою викоС Ніландера, Б Лідберга і Т Лінда "Виявлення наний в вигляді призми, один з кутів біля основи газу за допомогою поверхневого плазмонного реякої дорівнює 90°, а другий кут біля основи вибизонансу" (див Nylander, С , Liedberg, В, Lmd, T рається рівним куту поверхневого плазмонного Gas detection by means of surface plasmon resoрезонансу для даного показника заломлення приnance /Sensors and Actuators, 3 - P 79 - 88 зми, речовини електропровідної плівки і даного 1982/83) (Фіг 2) показника заломлення зовнішнього середовища плюс-мінус 5% Для збудження поверхневих плазмонів авторами цієї роботи в якості оптично більш щільного На фіг 1 - показано зміщення кривої плазмонсередовища використовувалось скляна призма ного резонансу повного внутрішнього відбивання (2) з нанесеною На фіг 2- показаний пристрій для збудження на її основу металічною плівкою визначеної товповерхневого плазмонного резонансу зі скляною щини (4) (в випадку золотої, срібної або мідної призмою і нанесеною на її основу електропровідплівки ця товщина повинна бути порядку 40нм) ною або напівпровідниковою плівкою, де 1 - падаПоверхня плівки знаходилася в контакті з менш юче р-поляризоване світло, 2 - скляна призма, 3 щільним ЗОВНІШНІМ середовищем (повітря, вода), відбите світло, 4 - металічна або напівпровіднищо містить в собі домішки речовини, що визначакова плівка, 5 - поверхнева плазмонна хвиля ється В результаті цього контакту речовина, що На фіг 3 - схематично показана крива поверхвизначається, адсорбувалась на поверхні металіневого плазмонного резонансу чної плівки, створюючи молекулярний шар ЗбуНа фіг 4 показана блок-схема пристрою для дження поверхневих плазмонів здійснювалось детектування та визначення концентрації бюмолепроменем світла (1), падаючим зі сторони призми кул та молекулярних комплексів, де 6 - He-Ne лана поверхню металічної плівки Кут падіння світла зер, 7 - падаюче р-поляризоване світло, 8 - детекміг змінюватись шляхом повороту призми Експеторний блок зі скляною призмою та нанесеною на риментально вимірювалось зменшення інтенсиви основу електропровідною або напівпровідниконості відбитого випромінювання за рахунок погливою плівкою, робочою кюветою та пристроєм понання падаючого випромінювання як наслідок певороту призми, 9 - відбите світло, 10 - блок оброретворювання енергії електромагнітної хвилі в бки сигналу з фотодетектором, аналого-цифровим енергію поверхневих плазмонів перетворювачем та компьютером Заявлені об'єкти вирішують задачу зростання достовірності детектування та КІЛЬКІСНОГО визначення концентрації речовини, що аналізується Поставлена задача вирішується тим, що в відомому способі детектування та визначення концентрації бюмолекул, що включає опромінення межі поділу оптично більш щільного середовища, що має показник заломлення п1, з оптично менш щільним середовищем, що має показник заломлення п2, які задовольняють умові п1 > п2, р-поляризованою електромагнітною хвилею переважно видимого діапазону, з боку оптично більш щільного середовища, реєстрацію відбитого від межі поділу випромінювання та його аналіз, опромінення межі поділу проводять, використовуючи набір кутів падіння р-поляризованої електромагнітної хвилі для всього набору кутів падіння і визначають КІЛЬКІСТЬ бюмолекул і молекулярних комплексів шляхом математичної обробки даних вимірів по спеціально розробленому алгоритму На фіг 5 - показаний пристрій для збудження поверхневого плазмонного резонансу з робочою кюветою, скляною призмою, один із кутів якої дорівнює 90° і нанесеною на її основу електропровідною або напівпровідниковою плівкою, де 11 - падаюче р-поляризоване світло, 12 - вихідний отвір, 15 - металічна або напівпровідникова плівка, 16 скляна призма, 17 - відбите світло На фіг 6 показані експериментальні залежності кінетики кута поверхневого плазмонного резонансу, які відповідають висадженню білка на чут Залежність інтенсивності відбитого випромінювання (3) від кута падіння електромагнітної хвилі на поверхню плівки (крива плазмонного резонансу), має мінімум при визначеному куті падіння (кут плазмонного резонансу) (cpspr) (Фіг 3) Форма кривої плазмонного резонансу і, зокрема, положення мінімуму, залежать від показника заломлення призми, оптичних постійних та товщини електропровідної плівки, оптичних постійних зовнішнього середовища, яке знаходиться з протилежного боку по відношенню до падаючого та відби 8 46018 де R,(x) означає розраховану величину коефіцієнту того випромінювання, та від оптичних параметрів і 0 відбивання, a R, - відповідне експериментальне товщини шару молекул, які знаходяться на або значення Мінімізація цієї функції за допомогою поблизу зовнішньої поверхні плівки якого-небудь з відомих алгоритмів, наприклад, Роздивимось сказане більш докладно Експесимплексним методом (див там же) дозволяє, в риментально вимірювана крива поверхневого плапринципі, визначити невідомі параметри адсорбозмонного резонансу залежить від оптичних постійваного шару, зокрема, його товщину та показник них (показників заломлення та поглинання) всіх заломлення фаз, з якими взаємодіє електромагнітна хвиля (матеріалу призми, матеріалу електропровідного За допомогою найдених таким шляхом велишару, речовини, що визначається, адсорбованої чин можно потім визначити масу адсорбованої на поверхні цього шару, зовнішнього середовища речовини за формулами, одержаними з виразу та інших фаз, що можуть, в залежності від умов для молекулярної рефракції речовини, що визнавимірів, входити в систему, що досліджується), а чається також геометричної товщини всіх шарів, в тому А = d(n-nQ)/(dn/ dc) (6) числі золотої плівки та визначаємого адсорбова2 Тут Г - величина поверхневого надлишку, г/см , d ного шару Ця залежність може бути представлена товщина шару, см, по - показник заломлення зовв слідуючому виді (див кн "Основы эллипсометнішнього середовища, п - показник заломлення рии" // А В Ржанов, К К Свиташев, визначаємої речовини Типове значення dn/dc для А И Семененко, Л В Семененко, В К Соколов / різних білків дорівнює 0,188cm3/g (див Под ред А В Ржанова - Новосибирск, "Наука" М Malmstem, Elhpsometry studies of protein layers (Сиб отд) -1978 - 4 2 4 с ) adsorbed at hydrophyhc surfaces J Colloid and InRp(