Спосіб моделювання недостатності клітин панета

Спосіб моделювання недостатності клітин Панета, що включає введення тваринам цитотоксичної сполуки, утримування тварин в умовах віварію, проведення досліджень, який відрізняється тим, що як цитотоксичну сполуку використовують дитизон, який вводять тваринам одноразово парентеральним шляхом. (19) (21) u201100999 (22) 31.01.2011 (24) 25.07.2011 (46) 25.07.2011, Бюл.№ 14, 2011 р. (72) ГОРОХОВСЬКИЙ ЄГОР ЮРІЙОВИЧ, ЄЩЕНКО ЮЛІЯ ВІТАЛІІВНА (73) ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД "ЗАПОРІЗЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ" МІНІСТЕРСТВА ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ 3 61779 ртуттю, некротичні клітини Панета зустрічалися значно частіше, проте інші клітини кишкового епітелію залишалися інтактними, що свідчило про селективне ушкодження клітин Панета. Ознаками, спільними з найближчим аналогом, є: - введення тваринам цитотоксичної сполуки; - утримування тварин в умовах віварію; - проведення досліджень. До недоліків найближчого аналога можна віднести те, що введення цитотоксичної речовини повинно здійснюватися багаторазово, а також те, що не відбувається повне виключення клітин Панета, оскільки деяка їх частина все ж зберігається, і це не дозволяє моделювати повну недостатність клітин Панета та досліджувати роль дефенсинів у виникненні та розвитку захворювань тонкого кишечника. Для реалізації методу потрібен значний час (не менше 17 діб). Також усі сполуки ртуті є надзвичайно токсичними речовинами, які викликають ураження багатьох органів тварин, а не тільки клітин Панета тонкого кишечника, та можуть становити загрозу для здоров'я дослідників, що потребує спеціальних умов для проведення дослідів. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб моделювання недостатності клітин Панета, який шляхом введення цитотоксичної сполуки викликає тотальне ушкодження клітин Панета, що дозволяє моделювати недостатність цих клітин та досліджувати роль дефенсинів в умовах in vivo при виникненні та протіканні захворювань тонкого кишечника, вдосконалювати існуючі та розробляти нові методи і препарати для їх лікування. Суттєвими ознаками способу є: - парентеральне введення тваринам розчину дитизону, що селективно ушкоджує клітини Панета; - утримування тварин в умовах віварію протягом щонайменше 4 годин; проведення досліджень при стані недостатності клітин Панета. Відмінними від найближчого аналога ознаками способу є: - одноразове парентеральне введення тваринам розчину дитизону, що селективно ушкоджує клітини Панета; - утримування тварин в умовах віварію протягом щонайменше 4 годин; проведення досліджень при стані недостатності клітин Панета. Спосіб здійснюють таким чином: тваринам внутрішньочеревинно вводять розчин дитизону в 4 дозі 95-100 мг/кг ваги тіла, який при парентеральному введенні призводить до тотального некрозу вищевказаних клітин. Ознаки тотального некрозу клітин Панета спостерігають уже через 1 годину після введення речовини. Повну відсутність клітин Панета спостерігають через 4 години протягом 2 діб, після чого починається процес поступового відновлення клітин Панета. Інші клітини кишкового епітелію при введенні дитизону залишаються неушкодженими. За допомогою запропонованого методу можна проводити дослідження ролі дефенсинів, які містяться в секреторних гранулах клітин Панета, у виникненні, протіканні захворювань тонкого кишечника; розробку нових або вдосконалення вже існуючих методів та препаратів для лікування цих захворювань. Приклад конкретного виконання: у дослідженні було використано 56 щурів, віком 10-12 місяців, вагою 207±21 г. Дослідним тваринам (28 особин) внутрішньочеревинно вводили водно-аміаковий розчин дитизону в дозі 100 мг/кг. Дослідних тварин, у кількості 4-х особин, яким вводили дитизон, а також контрольних тварин у тій же самій кількості, виводили з досліду шляхом декапітації через 1, 2, 4, 24, 48 годин; 5 та 14 діб відповідно. У тварин брали шматочки клубової кишки, які фіксували в нейтральному формаліні, та за загальноприйнятою гістологічною методикою заливали в парафін. З парафінових блоків робили мікротомні зрізи 6 мкм завтовшки. Зрізи забарвлювали гематоксилін-флоксином. Наявність клітин Панета визначали як за характерною флоксиновою реакцію на дефенсинмісткий секреторний матеріал в цитоплазматичних гранулах цих клітин, так і за морфологічним критерієм (клітини пірамідальної форми, які розташовані в базальних відділах кріпт). Інтенсивність цитохімічної реакції флоксину оцінювали напівкількісним методом за трибальною шкалою. Слабко виражену реакцію оцінювали в 1 бал, 2 бали - реакцію середньої інтенсивності, 3 – інтенсивно виражену реакцію. На основі оцінки інтенсивності реакції флоксину в 100 клітинах розраховували середнє значення інтенсивності реакції. Статистична обробка полягала в розрахунку середнього арифметичного та його похибки. Для порівняння даних дослідних та контрольних вибірок використовували непараметричний критерій Мана-Уітні. Усі розрахунки проводили за допомогою статистичного пакету Statistica 6.0. Результати досліджень наведені в таблиці. Таблиця Показники реакції флоксину в щурів після введення дитизону Термін виведення тварин з досліду 1 год. Інтенсивність реакції флоксину (ум. од.) Дослідні тваКонтрольні тварини рини 0,7±0,02* 2,3±0,09 Середня кількість клітин Панета (клітин на крипту) Дослідні тварини Контрольні тварини 4,3 4,6 5 61779 6 Продовження таблиці 2 год. 4 год. 24 год. 48 год. 5 діб 14 діб 2,2±0,11 2,3±0,06 2,2±0,09 2,3±0,06 2,3±0,08 2,2±0,10 1,3±0,12* 1,7±0,09* 2,4±0,14 1,1* 0,8* 1,6* 4,3 4,6 4,5 4,6 4,6 4,4 4,5 *Р