Спосіб отримання одноланцюгових фрагментів днк

Спосіб отримання одноланцюгових фрагментів ДНК, в якому проводять полімеразну ланцюго 3 потрібен час, тому завдяки винаходу збільшується швидкість отримання одноланцюгових молекул ДНК. Після отримання дволанцюгової матриці ДНК дослідник має вибір для рішення декількох завдань: отримання одноланцюгових фрагментів, створення довгих послідовностей фрагментів ДНК, які повторюються, синтез кільцевих ДНК. Спосіб реалізується таким чином. І крок. Створення дволанцюгового фрагмента ДНК за допомогою ПЛР-аналізу із специфічними праймерами, підібраними на основі секвенованих послідовностей геномів. ІІ крок. Зв'язування одного з фрагментів ДНК праймером у кільце або у одно-дволанцюгові послідовності (Фіг. 1). Для зв'язування фрагменту ДНК у кільце чи формування одно-дволанцюгової послідовності ДНК конструюється такий праймер, частина якого буде відпалюватися на 3'-кінці, а інша на 5'-кінці одноланцюгової послідовності ДНК та проводять ПЛР. Після цього продукти ПЛР обробляють ДНК-лігазою. Наприкінці реалізації способу одноланцюгові ДНК-фрагменти будуть вільно плавати в розчині реакційної суміші. Одноланцюгові фрагменти ДНК легко відділити від дволанцюгових методом електрофорезу й одержати з агарозного гелю елюючим розчином. Приклад конкретного виконання. Для проведення ПЛР використовується наступна реакційна суміш (реактиви фірми "АмплиСенс", Москва). I крок. Реакційна суміш обсягом 30 мкл містить: 5x PCR-буфер - 5 мкл; MgSO4, 50 mM - 1,5 мкл; Н2О (деіонізована) - 3 мкл; dNTP-mix, 2 mМ 2,5 мкл; Таq-полімераза, 5 од/мкл -0,5 мкл; мінеральне масло - 10,5 мкл; 2 праймери, 3,3 OD/мол 61929 4 по 1 мкл; ТЕ-буфер з досліджуваною ДНК - 5 мкл. ПЛР проводять у режимі: денатурація 94°С - 1 хв., відпал 40-65°С - 1 хв., синтез 72°С - 1 хв. - 5 циклів; денатурація 94°С - 0,5 хв., відпал 40-65°С - 0,5 хв., синтез 72°С - 0,5 хв. - 40 циклів. Термінальну стадію синтезу проводять при 72°С - 3 хв. Очищені методом електрофорезу в агарозному гелі й виділені ТЕ-буфером дволанцюгові фрагменти ДНК використовують для вивільнення одноланцюгових фрагментів ДНК під час другого кроку. II крок. Реакційна суміш обсягом 26 мкл містить: 5-х PCR-буфер - 5 мкл; MgSO4, 50 mM - 1,5 мкл; Н2О (деіонізована) - 3 мкл; dNTP-mix, 2 mМ 0,25 мкл; Таq-полімераза, 5 од/мкл - 0,5 мкл; мінеральне масло - 10,5 мкл; 1 праймер, 3,3 OD/мол 0,1 мкл; ТЕ-буфер з досліджуваною ДНК - 5 мкл. ПЛР проводять у режимі: денатурація 94°С - 1 хв., відпал 40-65°С - 1 хв., синтез 72°С - 1 хв. - 1 цикл. Термінальну стадію синтезу проводять при 72 °С 1 хв. Продукти ПЛР обробляють Т4 ДНК-лігазою протягом 65 хв. при температурі 22°С. Очищені методом електрофорезу в агарозному гелі одноланцюгові фрагменти ДНК виділяють ТЕ-буфером. Технічне рішення представлене графічно. Фіг. - Схема отримання одноланцюгових фрагментів ДНК: 0 - фрагмент досліджуваного геному організму; а - дволанцюговий ДНК-фрагмент; b одноланцюговий ДНК-фрагмент; с - однодволанцюгова послідовність ДНК; d - дволанцюгова кільцева ДНК; e - обробка ДНК-лігазою; І, II кроки методу; РРРРР, DDDDD, ZZZZZ - праймери; А, Б -варіації методу. Спосіб може знайти промислове застосування при синтезі ДНК-інсектицидів, виробництві ліків на основі ДНК (ДНК-ліки). 5 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков 61929 6 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601