Спосіб ранньої диференційної діагностики доброякісних та злоякісних новоутворень шийки матки

Спосіб ранньої диференційної діагностики доброякісних та злоякісних новоутворень шийки матки шляхом виконання цитологічних та гістохімічних досліджень крові, який відрізняється тим, що дослідження проводять шляхом забору периферичної крові пацієнток, поміщення її у пробірки з етилендіамінтетратриоцтовою кислотою (EDTA), центрифугують при 3000 об/хв протягом 25 хвилин при кімнатній температурі, ізолюючи за градієнтом щільності моноцити периферичної крові (МПК), які U 2 (19) 1 3 62535 Однак вказана методика має певні недоліки, які здатні затримати своєчасне лікування. Мазок може бути занадто тонким або товстим, забрудненим елементами крові, сперміцидними або антибактеріальними кремами, якими жінка користувалася в найближчий час. Можливе недостатнє профарбовування або погане розподілення клітинного матеріалу на склі. Навіть запропонована нова технологія - рідинна тонкошарова цитологія не має абсолютної чутливості і пропускає від 7 % і більше тяжких цервікальних уражень. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалення ранньої диференційної діагностики доброякісних та злоякісних новоутворень шийки матки шляхом вивчення відсоткового вмісту і імунофенотипів ДК методом проточної цитометрії, що дозволить підвищити вірогідність ранньої диференційної діагностики пухлинних новоутворень шийки матки. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з корисною моделлю, дослідження проводять шляхом забору периферичної крові пацієнток, поміщення її у пробірки з етилендіамінетратриоцтовою кислотою (EDTA), центрифугують при 3000 об/хв протягом 25 хвилин при кімнатній температурі, ізолюючи за градієнтом щільності моноцити периферичної крові (МПК), які містять дендритні клітини (ДК), що здатні до активування Т-клітин, МПК відмивають двічі у фосфатно-сольовому буфері, забарвлюють їх антитілами: anti - CD11с FITC, anti - CD123 - РЕ, anti - HLA - DR - РЕ -Су5, anti - CD80 - FITC і anti - CD86 - РЕ, після чого клітини інкубують протягом 30 хвилин при температурі 4 °С з моноклональними антитілами до поверхневих антигенів і незв'язані антитіла відмивають двічі у фосфатно-сольовому буфері, що містить 0,2 мл EDTA і 0,5 % альбуміну бичачої сироватки, потім проводять кількісну оцінку і імунофенотипування дендритних клітин методом проточної цитометрії, і при значеннях відсотка мієлоїдних і лімфоїдних ДК і експресії HLA-DR вище норми та рівня експресії CD80 і CD86 нижче норми констатують наявність злоякісного новоутворення, а при значеннях відсотка ДК і рівня експресії HLA-DR вище або за нормою та експресії CD80 і CD86 нижче та за нормою діагностують відсутність новоутворення або його доброякісний характер. Пацієнти із раком шийки матки не здатні на формування цитостатичної Т-клітинної відповіді 4 проти онкоантигенів. Це ймовірно є наслідком низьких рівнів експресії як вірусних протеїнів, так і молекул основного комплексу гістосумісності, а також відсутності ко-стимулюючих молекул, що є вкрай важливими для сприйняття Т-клітин тканиною пухлин. Дендритні клітини (ДК) - це могутні, антиген-презентуючи клітини, які можуть ініціювати первинну Т-клітинну імунну відповідь до антигенів. Вони грають центральну роль у ініціюванні і регулюванні імунних відповідей [3] та можуть бути виявлені за допомогою проточної цитометрії. Мієлоїдні дендритні клітини (ДК1) і плазмацитоїдні дендритні клітини (ДК2) - два головних підтипи людських дендритних клітин. Відомо, що ДК1 є ефективними Т-клітинними стимуляторами, які викликають специфічну протипухлинну імунну відповідь, проте функція ДК2 не встановлена напевно. ДК не лише стимулюють специфічну протипухлинну відповідь, а також сприяють пухлинній толетолерантності [4]. Спосіб здійснюється наступним чином. У пацієнтки проводять забір периферичної крові, виділяють моноцити периферичної крові (МПК) за градієнтом щільності, які містять ДК, забарвлюють їх антитілами: anti - CD11с - FITC, anti CD123 - РЕ, anti - HLA - DR - РЕ - Су5, anti - CD80 FITC і anti - CD86 - PE, проводять аналіз відсоткового вмісту і імунофенотипів ДК методом проточної цитометрії. Приклад конкретного виконання способу: Біологічний матеріал для дослідження отримували у пацієнток з гістологічно підтвердженим раком шийки матки (РШМ), що знаходилися на лікуванні в гінекологічному відділенні Одеської обласної клінічної лікарні в період з січня 2009 по жовтень 2010 року. Усі пацієнтки раніше не піддавалися хіміотерапії і променевій терапії. Усі пацієнтки з РШМ відносилися до ранньої стадії захворювання (Іа1; Іb2). Для групи контролю були довільно обрані здорові жінки при гінекологічних оглядах на клінічних базах кафедри акушерства і гінекології № 1 Одеського національного медичного університету в той же термін. В результаті було обстежено 59 жінок, у тому числі, 27 з РШМ і 32 здорових. Усі жінки, включені в дослідження, дали інформовану згоду. Результати наведені у таблицях 1, 2. Таблиця 1 Відсотковий вміст дендритних клітин 1 і 2 типів у пацієнток РШМ і здорових жінок ДК Здорові (n=32) (В %) 21,22±7,69 1,14±0,75 CD11c+(ДК1) СО123+(ДК2) РШМ (n=27) (в %) 7,00±1,49 0,67±0,48 Р