Спосіб фарбування мазків венозної крові

Спосіб фарбування мазків венозної крові, що включає фарбування висушених мазків крові фарбою Май-Грюнвальда (насиченим розчином еозиновокислого метиленового синього, приготовле Винахід відноситься до біологи та медицини, а саме до загальноклінічних та імунологічних методів дослідження і стосується визначення формули крові та проведення цитоморфометричних досліджень Відомий спосіб фарбування клітин у мазках крові за Май-Грюнвальдом (Б Ромейс Микроскопическая техника - М Изд-во иностранной литературы, 1953 -718с - С 323), який складається з фарбування висушених мазків крові фарбою МайГрюнвальда (насиченим розчином еозиновокислого метиленового синього, приготовленим на метиловому спирті), додавання рівного йому об'єму дистильованої води, видалення розведеного фарбника, ополіскування у дистильованій воді, висушування, визначення клітин під мікроскопом Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є фарбування висушених мазків крові насиченим розчином еозиновокислого метиленового синього, ополіскування у дистильованій воді, висушування, визначення клітин під мікроскопом Недоліками способу є 1) недостатня якість фарбування клітин крові і як наслідок - низька точність результатів визначення формули крові та проведення цитоморфометричних вимірів, 2) додавання рівного об'єму фарбника до об'єму дистильованої води призводить до розведення реактиву і неможливості повторного його використання, що підвищує вартість аналізу Причинами, що перешкоджають досягненню результату, є ним на метиловому спирті), видалення фарбника, дофарбування їх у 10-15% розчині фарби Гімза (розчин суміші метиленазура, метиленового фіолетового, метиленового синього та еозину), приготовленій на буфері (рН 6,8-7,0), ополіскування у дистильованій воді, диференціювання, ополіскування у дистильованій воді, висушування, визначення клітин під мікроскопом, який відрізняється тим, що перед фарбуванням додатково проводять фіксацію мазків та їх експозицію у буферному розчині (рН 6,8-7,0) недостатнє фарбування ядра і цитоплазми при фарбуванні препаратів фарбником еозиновокислим метиленовим синім, за допомогою якого добре виявляються лише гранули в гранулоцитах, великий суб'єктивізм аналізу препарату крові при наявності нечіткого фарбування ядра, що потребує високої кваліфікації гематолога-імунолога Відомий також спосіб фарбування мазків крові за Гімзою (Б Ромейс Микроскопическая техника М Изд-во иностранной литературы, 1953-718с С 324), який включає фіксацію висушених мазків крові, висушування, фарбування їх фарбою Гімза, що складається з розчину суміші фарбників метиленазура, метиленового фіолетового, метиленового синього та еозину, приготовленою на буфері (рН 6,8-7,0), видалення фарбника струшуванням, ополіскування кип'яченою або забуференою (рН 6,8-7,0) дистильованою водою, висушування препаратів на повітрі, визначення клітин під мікроскопом Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється є фіксація висушених мазків крові, висушування, фарбування їх фарбою Гімза (розчин суміші метиленазура, метиленового фіолетового, метиленового синього та еозину), приготовленою на буфері (рН 6,8-7,0), ополіскування дистильованою водою, висушування препаратів на повітрі, визначення клітин під мікроскопом Недоліками способу є недостатня якість фарбування клітин крові і як наслідок - низька точність результатів визначення формули крові та проведення цитоморфометричних вимірів о (О (О Причинами, що перешкоджають досягненню результату, є недостатньо чітке фарбування гранул у клітинах мазка крові при фарбуванні препарату фарбою Гімза (сумішшю метиленазура, метиленового фіолетового, метиленового синього та еозину), суб'єктивізм при диференціюванні клітин крові при наявності нечіткого фарбування ядра та гранул клітин, що потребує високої кваліфікації гематолога - імунолога Відомий також спосіб фарбування мазків крові за Паппенгеймом (Б Ромейс Микроскопическая техника - М Изд-во иностранной литературы, 1953 -718с - С 326), який включає фарбування висушених мазків крові фарбою Май-Грюнвальда (насиченим розчином еозиновокислого метиленового синього, приготовленим на метиловому спирті), додавання дистильованої води, видалення розведеного розчину еозиновокислого метиленового синього, але без промивання мазків, потім дофарбування їх у 10-15% розчині фарби Гімза (сумішшю метиленазура, метиленового фіолетового, метиленового синього та еозину), приготовленій на буфері (рН 6,8-7,0), ополіскування у дистильованій воді, диференціювання, ополіскування у дистильованій воді, висушування, визначення клітин під мікроскопом 62690 7,0), Спільними ознаками з рішенням, що заявляється, є фарбування висушених мазків крові фарбою Май-Грюнвальда (насиченим розчином еозиновокислого метиленового синього, приготовленим на метиловому спирті), видалення фарбника, дофарбування їх у 10-15% розчині фарби Гімза, приготовленій на буфері (рН 6,8-7,0), ополіскування у дистильованій воді, диференціювання, ополіскування у дистильованій воді, висушування, визначення клітин під мікроскопом Недоліками способу є 1) недостатня якість фарбування мазків венозної крові, яка зберігалась понад ЗО хвилин з моменту взяття і як наслідок - низька точність морфологічної оцінки клітин у мазках, що є передумовою похибок при визначенні формули крові та проведенні цитоморфометричних вимірів, 2) додавання до насиченого розчину фарбника Май-Грюнвальда дистильованої води призводить до розведення реактиву і неможливості повторного його використання, що підвищує вартість аналізу Причинами, що перешкоджають досягненню результату, є поява зернистості у плазмі та на поверхні клітин у мазках з венозної крові, яка з'являється під час зберігання зразка крові, що призводить до суб'єктивізму при визначенні клітин крові і потребує високої кваліфікації гематолога - імунолога В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб фарбування мазків венозної крові шляхом підвищення якості фарбування клітин крові за рахунок усунення фарбування кислих позаклітинних речовин і структур, що дозволяє отримувати чітке морфологічне зображення клітин у мазку, якісне фарбування всіх структур клітин, підвищити об'єктивність, точність і оперативність морфологічної оцінки препаратів венозної крові Суттєвими ознаками запропонованого рішення є фіксація препаратів, експозиція мазків у буферному розчині (рН 6,8 фарбування мазків фарбою Май-Грюнвальда (насиченим розчином еозиновокислого метиленового синього, приготовленим на метиловому спирті), видалення фарбника, дофарбування мазків крові 10-15% розчином фарби Гімза (розчин суміші метиленазура, метиленового фіолетового, метиленового синього та еозину) на буфері (рН 6,8-7,0), ополіскування у дистильованій воді, диференціювання, ополіскування у дистильованій воді, висушування на повітрі, визначення клітин під мікроскопом ВІДМІННИМИ ВІД прототипу ознаками є фіксація мазків та їх експозиція у буферному розчині (рН 6,87,0) Однією З ГОЛОВНИХ обробок стабілізованих фіксованих клітин є їх фарбування Саме завдяки фарбуванню отримано більшість відомостей про структуру та властивості тих чи інших клітин Фарбою Гімза профарбовуються переважно ядра клітин, а гранули гранулоцитів - фарбою Май-Грюнвальда Причому відомо (Б Ромейс Микроскопическая техника - М Изд-во иностранной литературы, 1953718с -С 324), що найбільш якісне фарбування клітин крові в мазках досягається при рН 6,8-7,0 Фарбування за способом-прототипом дає ЯКІСНІ результати тільки стосовно мазків, що приготовлені з капілярної крові або з венозної, яка зберігалась не більше ЗО хвилин Зразка капілярної крові мало за об'ємом (0,1-0,Змл), тому він придатний тільки для загального аналізу крові При цьому мазки для цитоморфометричного аналізу лейкоцитарної формули крові і еритроцитів приготовляють відразу після отримання крові А для серії імунологічних ДОСЛІДІВ ВІД обстеженого переважно забирають венозну кров у достатніх об'ємах (3-5-1 Омл) на антикоагулянтах, які не впливають на результати ДОСЛІДІВ Тому є можливість при серії досліджень гематологічні та імунологічні досліди проводити через деякий час (35 годин) Але за цей проміжок часу в плазмі крові і у формених елементах крові відбуваються ферментативні та ЦИТОЛОГІЧНІ реакції з утворенням кислих позаклітинних речовин і структур Наприклад, ЦИТОЛОГІЧНІ реакції відбуваються при деградації частини гранулоцитів і насамперед нейтрофілів, внаслідок чого в плазму надходять гранули з кислотними властивостями Причому нейтрофіли виділяють гранули і без деградації Нейтрофіли містять гранули двох типів первинні азурофільні гранули - це лізосоми, до складу яких входять кислі пдролази, мієлопероксидаза та лізоцим і вторинні специфічні гранули, в яких додатково до лізоцима міститься лактоферш та антибіотичні білки Речовини і структури (гранули) з кислотними властивостями осідають на еритроцитах, лейкоцитах, профарбовуються у вигляді азурофільних гранул розчином МайГрюнвальда, що затрудняє цитологічний аналіз Для уникнення фарбування цих структур необхідно привести їх рН до нейтрального рівня (близького до 7,0), при якому ці структури не вступлять у реакцію ні з кислими, ні з лужними фарбниками і тому не будуть профарбовуватися Отже, таким способом можна уникнути профарбовування речовин і гранул 62690 з кислотними властивостями, які є наслідком ферментативних та цитологічних реакцій, що відбуваються у венозній крові за проміжок часу від забору крові до постановки гематологічних та імунологічних ДОСЛІДІВ, і які у мазках венозної крові при фарбуванні за способом-прототипом виявляються у вигляді азурофільної зернистості у плазмі, осідають на еритроцитах та лейкоцитах Для досягнення таких умов фарбування, тобто близького до нейтрального рівня рН (7,0), необхідно проводити експозицію мазків, приготовлених з венозної крові, у буфері з рН 6,8-7,0 Але цей буферний розчин готується на дистильованій воді і має знижений вміст ІОНІВ (знижену іонну силу) у порівнянні з їх вмістом у КЛІТИНІ Без попередньої фіксації буферний розчин (рН 6,8-7,0) призводить до лізису (руйнування) клітин через проникнення в них за градієнтом концентрації молекул води з буферного розчину Тому з метою запобігання руйнування клітин та підвищення їх СТІЙКОСТІ ДО наступної обробки буферним розчином з рН 6,8-7,0 проводили фіксацію мазків венозної крові Введення додаткового етапу експозиції мазків венозної крові у буфері з рН 6,8-7,0 після фіксації, саме перед фарбуванням мазка, дає змогу адаптувати рН препарату до процесу фарбування, оптимальний рН для якого 6,8-7,0 і таким чином дозволяє позбутися фарбування кислих позаклітинних речовин і структур, що мають вигляд зернистості у плазмі та на поверхні клітин у мазках, яка з'являється за проміжок часу від забору венозної крові до постановки гематологічних та імунологічних ДОСЛІДІВ внаслідок ферментативних та цитологічних реакцій з утворенням кислих позаклітинних речовин і структур при деградації гранулоцитів (насамперед нейтрофілів) Це також дозволить при проведенні серії досліджень зберігати деякий час мазки венозної крові до фарбування для стандартизації фарбування таких мазків фахівцем, отримувати додаткові незалежні консультації гематолопв-імунолопв в інших лабораторіях і економити час при проведенні серії експериментів для наукових лабораторій Саме завдяки використанню всієї заявленої сукупності ознак спосіб дозволяє більш якісно фарбувати мазки крові, приготовлені з венозної крові, шляхом уникнення фарбування кислих позаклітинних речовин і структур, що знизить частоту похибок гематолога-імунолога при ОЦІНЦІ мазка і зробить аналіз препаратів більш об'єктивним, інформативним Чітка морфологія клітин, яка досягається фарбуванням мазків венозної крові за запропонованим методом, також дозволить підвищити швидкість аналізу таких препаратів Крім того, економічність та доступність способу дозволяє використовувати його у звичайних експериментальних і КЛІНІЧНИХ лабораторіях Спосіб здійснюють таким чином Комп'ютерна верстка Т Чепелєва З отриманої венозної крові виготовляють мазки, проводять їх фіксацію, після якої можливе тимчасове зберігання мазків, потім проводять експозицію у буфері (рН 6,8-7,0) Спочатку мазки крові фарбують насиченим розчином фарби Май-Грюнвальда (розчином еозиновокислого метиленового синього, приготовленим на метиловому спирті), ополіскують у дистильованій воді, а потім дофарбовують 10-15% розчином фарби Пмза (розчин суміші метиленазура, метиленового фіолетового, метиленового синього та еозину), приготовленої на буфері (рН 6,87,0), після чого ще раз ополіскують у дистильованій воді, диференціюють для видалення надлишку фарби, ополіскують у декількох порціях дистильованої води, висушують на повітрі та проводять визначення клітин під мікроскопом Приклад конкретного виконання Проводили забір крові з вени на антикоагулянті (гепарин, 20од/мл) у 15 обстежених 3 отриманої крові готували мазки крові стандартним способом Фіксували препарати метиловим спиртом протягом 5 хвилин, а потім проводили їх експозицію у буфері Соренсона з рН 6,8 - суміші рівних частин 1/15 молярного розчину двозаміщеного фосфорнокислого натрію дванадцятиводного (ЫагНРСч х 12Н2О) 11/15 молярного розчину однозаміщеного фосфорнокислого калію (КН2РО4) протягом 4 хвилин Мазки крові фарбували 1 хвилину насиченим розчином фарби Май-Грюнвальда (розчином еозиновокислого метиленового синього, приготовленим на метиловому спирті), ополіскували у дистильованій воді, а потім дофарбовували 13 хвилин 10%-ним розчином фарби Пмза (розчин суміші метиленазура, метиленового фіолетового, метиленовогосинього та еозину), приготовленої на буфері Соренсона з рН 6,8, після чого ще раз ополіскували препарати у дистильованій воді Пофарбовані препарати диференціювали 1 секунду у 0,01%-му розчині соляної кислоти на дистильованій воді, ополіскували у трьох порціях дистильованої води, висушували на повітрі та проводили визначення клітин під мікроскопом Виявили, що при фарбуванні мазків венозної крові запропонованим нами способом зафарбовування кислих позаклітинних речовин і структур (гранул) у вигляді зернистості у плазмі та на поверхні клітин відсутнє, а якість фарбування структур клітин у препаратах добра Ядра мають червонувато-фіолетовий колір, цитоплазма лімфоідних клітин світло-синя, лімфоідна азурова зернистість яскрава пурпурно-червона, мієлоїдна зернистість фіолетова з коричневофіолетовим ВІДТІНКОМ, нейтральна 9 зернистість коричнювата до синюваторожевої, еозинофільна коричнювато-оранжева до кирпично-червоної Еритроцити - рожеві Таким чином, заявлене рішення відповідає критеріям винаходу Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119