Спосіб діагностики бронхолегеневої патології у дітей

Винахід, що заявляється, відноситься до медицини, точніше до мембранології, і може знайти застосування в пульмонології для визначення метаболічних зрушень в крові при бронхолегеневій патології у дітей для покращення лікування данного контингенту хворих. З різних причин, останнє десятиріччя характеризується збільшенням числа дітей з рецидивними та хронічними захворюваннями органів дихання. Все частіше реєструється трансформація рецидивних захворювань в хронічні та важкі за перебігом форми. Часті хронічні респіраторні захворювання можуть приводити до порушення фізичного та нервово-психічного розвитку дітей, сприяють зниженню функціональної активності імунітету та зриву компенсаторно-адаптаційних механізмів організму. Згідно сучасних наукових уявлень, на патогенетичний розвиток хронічного запального процесу впливають медіатори ліпідної природи. Рівень поліненасичених жирних кислот (ПНЖК), зокрема арахідонової кислоти та її метаболітів відображає ступінь розвитку запалення. Збалансування жирнокислотного спектру мембран та процесів вільно-радикального окислення забезпечує підтримку гомеостазу. Отже визначення певних співвідношень жирних кислот дає можливість отримати необхідну інформацію про склад мембранних ліпідів, стан вільно-радикальних процесів, що залежать від них. Існує багато способів діагностики запалення у хворих на бронхіт: клінічні, біохімічні, морфологічні. Висока інформативність досягається сполученням різних способів діагностики. Саме від точності встановленого діагнозу залежить своєчасність призначення специфічного, патогенетично обґрунтованого лікування, необхідного для попередження розвитку ускладнень. Відомий "Способ определения воспалительного процесса дыхания у детей" [1], шляхом визначення вмісту мієлопероксидази та катіонних білків, що досліджуються в нейтрофілах осаду промивної рідини порожнини рота. Недоліком цього метода є те, що він відображає стан місцевого імунітету. Відомий "Спосіб діагностики запалення при захворюваннях дихальної системи різного генезу." [2] Суть способу полягає у тому, що запальний процес виявляють по кількості моноцитів, лімфоцитів, ШОЄ і вмісту альбумінів та визначають коефіцієнт вираженості запалення. Недоліком цього методу є те, що він не дає уяви про можливість рецидивного перебігу захворювання. Найближчим аналогом - прототипом способу, що заявляється є спосіб визначення продуктів вільнорадикального окислення ліпідів за концентрацією малонового діальдегіду (МДА) в плазмі крові та еритроцитах за допомогою тіобарбітурової кислоти спектрофотометрично [3]. Однак МДА є вторинним продуктом пероксидації ненасичених жирних кислот і вказує на наявність та ступінь важкості запального процесу . В основу винаходу поставлена задача, спрямована на вдосконалення способу діагностики бронхолегеневої патології у дітей, шляхом оцінки стану перекисного окислення ліпідів на основі визначення жирнокислотного спектру мембран еритроцитів. Спосіб дозволяє виявити перебіг запального процесу у кожної конкретної дитини, та дає змогу проведення відповідного корегуючого лікування і профілактики з метою зниження даної патології у дітей. Поставлена задача вирішується шляхом оцінки стану перекисного окислення ліпідів, згідно винаходу визначають жирнокислотний спектр еритроцитарних мембран, а саме вміст ессенціальних ЖК (арахідонова, ейкозатрієнової, ейкозапентаєнової), а також суму ПНЖК; розраховують показник співвідношення сумарного вмісту полієнових кислот (ейкозатрієнової та ейкозапентаєнової) до вмісту арахідонової кислоти. При значенні показника 0,3 і менше діагностується гострий запальний процес, а при значенні більше 0,3 - хронічний процес запалення. Відмінною особливістю запропонованого способу є використання для діагностики бронхолегеневої патології нового, більш специфічного критерію, яким є вміст ПНЖК та жирно-кислотного спектру еритроцитів крові загалом. Це дає можливість дослідити саму основу метаболічних зрушень в організмі хворої дитини. У прототипі стан перекисного окислення характеризується на основі аналізу МДА, який є продуктом пероксидації ПНЖК і засвідчує лише факт активації процесу пероксидації, що не є специфічним і може спостерігатись при різноманітних патологіях. За доступними даними такий спосіб діагностики у дітей з бронхолегеневою патологією невідомий. Спосіб здійснюється методом газорідинної хроматографії. Цим методом визначають склад ессенціальних жирних кислот. Запропонований спосіб проводиться наступним чином: кров для дослідження у хворих беруть із кубітальної вени, вранці, натщесерце в кількості 3,0мл у пробірку з гепарином, із якої виділено еритроцити. Виділені еритроцити в кількості 0,5-1,0мл поміщають в пробірку з притертим корком ємністю 10мл, додають 5,07,0мл хлороформнометанової суміші (у співвідношенні 2:1) і тримають 30 хвилин в холодильнику. Для кращого розділення фаз додають 1мл дистильованої води. Далі відбирають хлороформну нижню фазу піпеткою Пастера. Для повної реакції етап екстракції повторюють двічі. Об'єднані хлороформні екстракти концентрують упарюванням досуха в потоці азоту при t - 45°С на водяній бані. Гідроліз та метилірування вищих жирних кислот ліпідів проводять наступним чином: до сухого осаду ліпідів додають 5мл 1% сірчаної кислоти в метанолі і переносять розчин в ампулу ємністю 10мл. Після запаювання проводять гідроліз і метилірування в термостаті при t - 85°С протягом 20 хвилин. Екстракцію метилірованих жирних кислот і холестерину проводять двічі гексанефірною сумішшю (у співвідношенні 1:1) в кількості 5мл. Для розділення фаз додають 1мл дистильованої води. Відбирають верхню фазу піпеткою Пастера. Об'єднані екстракти впарюють до суха в потоці азоту при t 45°С на водяній бані. Сухий осад розчиняють в 40-50мл чистого гексану і вводять у випарювач хроматографа в кількості 5мкл. Газохроматографічний аналіз спектру жирних кислот ліпідів еритроцитів крові здійснювали на хроматографі серії "Цвет-500" із полум'яно-іонізуючим детектором в ізотермічному режимі при наступних умовах: використання скляної колонки (розміри 3,0х3,0см) заповненої фазою 5% поліетіленглікольсукцинату (ПЕГС) на хромотоні N-AW-HMDS (зернування 0,125-0,150мм), температура колонки - 190°С, температура випарювача 250°С, затрати азоту та водню - 35мл/хв., затрати повітря - 200мл/хв., швидкість діаграмної стрічки - 240мм/год., чутливість шкали підсилювача - 10-7 А, об'єм проби, що вводиться 3-5мкм , тривалість аналізу 20 хвилин. Кількісну оцінку спектру ЖК ліпідів проводять за методом нормування площ і визначають долі кислот в процентах. Похибка визначення становить 10 % [4]. В спектрі ЖК визначали найбільш інформативні ЖК: насичені - мірістінова (С14:0), пальмітинова(С16:0), стеаринова (С18:0); мононенасичені - олеїнова (С18:1); поліненасичені - лінолева (С18:2), ліноленова (С18:3), арахідонова (С20:4), ейкозапентаєнова (С20:5). Обчислюють суми даних класів ЖК. Ці кислоти характеризують стан мембран, в тому числі ендотеліальних, де синтезуються регуляторні медіатори. Після цього розраховують показник співвідношення (К1) сумарного вмісту полієнових ЖК (ейкозатрієнова, ейозапентаєнова) до вмісту арахідонової кислоти. К1 - характеризує порушення метаболізму ЖК на етапі біосинтезу ейкозаноїдів простагландинів та інших ліпопероксидів - простациклінів, тромбоксанів, лейкотрієнів (лінолева кислота є попередником арахідонової кислоти, яка є субстратом синтезу даних медіаторів запалення). Вказані значення були встановлені на основі власного клінічного дослідження, описаного далі. Першу групу склали 20 дітей, хворих на обструктивний бронхіт. Друга група - 20 дітей з рецидивним обструктивним бронхітом. Контрольну групу склали 20 здорових дітей. Результати газохроматографічного аналізу жирно-кислотного спектру еритроцитів наведені в таблиці №1. Таблиця 1 Зміни жирнокислотного складу ліпідів в еритроцитах крові дітей з бронхолегеневою патологією. 1-група (обстр. бронхіт). 4,8+/-2,1 36,4+/-0,9 14,2+/-0,8 16,2+/-0,8 15,1+/-1,6 0,3+/-0,09 12,3+/-1,5 0,6+/-0,3 55,4+/-2,3 45,6+/-2,3 28,4+/-2,2 Назва ЖК С 14:0 С 16:0 С 18:0 С 18:1 С 18:2 С 18:3 С 20:4 С 20:5 Сума Нас. ЖК Сума Ненас. ЖК Сума ПНЖК 2-група (рецидив. обстр. бронхіт). 11,5+/-2,4 48,1+/-2,7 14,8+/-0,3 16,0+/-1,4 5,0+/-0,9 1,4+/-0,5 2,8+/-1,2 0,4+/-0,1 74,4+/-1,7 25,6+/-1,7 9,6+/-1,9 Контроль. 44,2+/-0,6 21,8+/-0,7 22,5+/-1,0 6,4+/-0,3 5,1+/- 0,4 66,0+/-0,8 34,0+/-0,8 11,5+/-0,7 Отримані результати виявили два варіанти порушень ліпідного метаболізму, за якими показники відрізняються і між собою і від контрольних значень. Так зниження рівня ПНЖК у хворих на рецидивний бронхіт може бути наслідком посиленого утворення медіаторів та свідчити про разбалансування системи регуляції ліпідного гомеостазу при якому страждають клітинні мембрани органів і тканин. Показник співвідношення полієнових кислот до арахідонової (К1) - є показником дестабілізації метаболізму ліпідів, який можна вважати діагностичним та прогностичним критерієм для оцінки характеру перебігу хвороби. Збільшений вміст полієнових жирних кислот в цій же групі можуть спричиняти негативні ефекти, завдяки властивостям своїх метаболітів та виступати у ролі прогностичної ознаки прогресування захворювання. Зміни суми ПНЖК та показника співвідношення полієнових кислот (С20:3+С20:5) до арахідонової кислоти наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Показники зміни метаболізму жирних кислот ліпідів еритроцитів крові, (%) Назва ЖК Сума ПНЖК С20:4 Сума полієн. к-т.: (С20:3+С20:5) К-1 (сума полієн./С20:4) 1-гр. (обстр. бронхіт) 28,4+/-2,2 12,3+/-1,5 0,9+/-0,3 0,1 2-гр. (рецидивний бронхіт) 9,6+/-1,9 2,8+/-1,2 1,8+/-0,5 0,6 Контроль 11,5+/-0,7 5,1+/-0,4 Сліди 0,0 Запропонований спосіб діагностики бронхолегеневої патології у дітей дозволяє оцінювати стан ендотелію за вмістом ПНЖК, які є важливим компонентом фосфоліпідів, з яких на 80% складається будь-яка мембрана, і сурфактант в тому числі. Література: 1. Маянская И.В. Ашкинази В.И. Жукова Е.А. Способ определения воспалительного процесса дыхания у детей. Патент РФ №2140080, 1999 г. МПК G01N33/487, 33/68. БИ, № 29, С. 368. 2. Ткач C.I. Чернишова О.М. Спосіб діагностики запалення при захворюваннях дихальної системи різного генезу. №34840 G01N33/53 заявка 99073978 від 13.07.1999., опубл. 15.03.2001. Бюл., №2, 2001. 3. Тодоріко Л.Д. Вміст в крові малонового діальдегіду при бронхіальній астмі у хворих різного віку / Актуальні питання реабілітації гастроентерологічних хворих. - Чернівці, 1996. - С. 352-354. 4. Гичка С.Г. Брюзгина Т.С. Вретик Г.М. Рева С.Н. Газохромотографический метод определения липидных показателей крови при ишемической болезни сердца // Украинский кардиологический журнал. - 1998. - №7-8. С. 50-52.