Експериментальна модель гіпергомоцистеїнемії

Винахід відноситься до галузі експериментальної медицини, а саме: до експериментальних моделей дієт, які дозволяють на лабораторних тваринах моделювати патологічний синдром гіпергомоцистеїнемії (ГГЦ) з метою дослідження його патогенетичних механізмів або з метою скринінгу препаратів, які знижують рівень гомоцистеїну у плазмі крові або препаратів, що можуть бути використані для корекції наслідків ГГЦ. Відомі експериментальні дієтичні моделі ГГЦ на основі стандартної крохмально-казеїнової дієти [Инструкция для приготовления основной диеты для крыс. Утверждена Институтом Питания АМН СССР 27.12.1952г. М., 1952, 8с.] передбачають гостре або хронічне навантаження гомоцистеїном [Chen С. et al. Intraperitoneal infusion of homocysteine increases intimal hyperplasia in balloon - injured rat carotid arteries.// Atherosclerosis -2002. -160 (1). P.103-114], а також [Southern F. et al. Increasing levels of dietary homocysteine with carotid endarterectomy produced proportionate increases in plasma homocysteine and intimal hyperplasia // Atherosclerosis -2001. -158 (1). -P.129-138] чи метионіном [Ungvari Z. et al. Disfunction of nitric oxide mediation in isolated rat arterioles with methionine diet nduced hyperhomocysteinemia.// Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. -1999. -19 (8). -P.1899-1904], а також [Durand P. et al. Acute methionine load-induced hyperhomocysteinemia enhances plateled aggregation, Thromboxane biosynthesis, and macrophage derived tissue factor activity in rats.//FASEB J -1997 -11 (13). -P.1157-1168]. Рівень загального гомоцистеїну (tHcy) при таких експериментальних дієтичних моделях ГГЦ зростав у 3,3 та 5,1 раз відповідно, що відповідає середньому ступеню ГГЦ. Ступені ГГЦ [Hankey GJ, Eikelboom JW. Homocysteine and vascular disease.//Lancet. -1999. -Jul 3; 354(9176). -P.407-413] наведено у табл.1 Таблиця 1 Ступені ГГЦ Ступінь ГГЦ Легка Середня Важка tНсу1/tНсу0* 2,6±0,6 6,6±3,5 ³ 10,0 співвідношення між рівнем гомоцистеїну при ГГЦ (tНсу1) та нормальним рівнем гомоцистеїну (tНсу0). Проте, такі моделі не відтворюють реальні механізми розвитку ГГЦ у людей, до яких відносяться спадкові дефекти ферментів обміну гомоцистеїна та(або) аліментарна недостатність вітамінів B6, В9 та В12. Найбільш близькою до винаходу за сукупністю ознак є хронічна експериментальна дієтична модель ГГЦ на основі стандартної крохмально-казеїнової дієти, яка передбачає поєднання недостатності вітаміну B9 (фолієвої кислоти) з навантаженням метионіном [Richard K.Le Leu. et al. Folate deficiency reduces the development of colorectal cancer in rats. //Carcinogenesis. -2000. -21 (12). -P.2261-2265. Композиція цієї дієти наведена у табл.2. Таблиця 2 Композиція експериментальної дієти із недостатністю вітаміна B9 та навантаженням L-метіоніном Складові частини Кількість, %% Казеїн 14,3 Крохмаль 34,4 Целюлоза 5,0 Сахароза 20,0 Олія 10,0 Свинячий лярд 10,0 Сольва суміш 3,5 Суміш вітамінів 1,0 Фолієва кислота у суміші вітамінів 0 L-метіонін 0,6 Холін 0,2 Сукцинілсульфатіазол 1,0 Рівень tHcy через 26 тижнів знаходження лабораторних тварин (male Sprague-Dawley rats) на цій дієті зростав у 2,3 рази, що відповідає легкому ступеню ГГЦ [Hankey GJ, Eikelboom JW. Homocysteine and vascular disease. //Lancet. -1999. -Jul 3; 354(9176). -P.407-413]. Використання у наведеній дієті недостатності тільки одного із трьох вітамінів, які приймають участь у метаболізмі гомоцистеїну, та недостатня доза L-метіоніну не забезпечує створення моделі ГГЦ, при якій би рівень гомоцистетну зростав до середнього та важкого ступенів. До того ж, термін дієти (26 тижнів) є занадто великим, що призводить до надмірного зростання витрат при проведенні таких експериментів. В основу винаходу поставлено задачу створити експериментальну дієтичну модель синдрому ГГЦ, яка шляхом поєднання аліментарної недостатності не одного, а трьох вітамінів із навантаженням метіоніном у вищій дозі, забезпечила б більш виражене зростання рівнів гомоцистеїну за короткий період перебування лабораторних тварин на цьому раціоні. Поставлена задача вирішується тим, що в композицію експериментальної дієти згідно з винаходом вводять очищені від вітамінів казеїн та крохмаль; із суміші вітамінів виключають вітаміни B6, В9 та В12; до суміші солей додають селеніт натрію; L-метіонін дають у вищій дозі, замість сукцинілсульфатіазолу використовують фармакопейний антимікробний препарат фталазол, який гальмує синтез вітамінів кишковою мікрофлорою, але не всмоктується, не виявляє системної дії та не впливає на рівень tHcy у плазмі крові. Композиція запропонованої дієти наведена у табл.3 Таблиця 3 Композиція експериментальної дієти із недостатністю вітамінів B6, В9 та В12 та навантаженням L-метіоніном Складові частини Казеїн Крохмаль Целюлоза Олія Свинячий лярд Сольова суміш Суміш вітамінів Вітаміни B6, В9 та В12 у суміші вітамінів L-метіонін Фталазол Кількість, %% 17,0 65,4 2,0 5,0 5,0 3,5 0,1 0 1,0 1,0 Сольова суміш, яку виготовляють за затвердженою методикою [Инструкция для приготовления основной диеты для крыс. Утверждена Институтом Питания АМН СССР 27.12.1952г. М., 1952, 8с.], доповнена натрію селенітом в кількості 0,0028% [Jamada K. et al. Extremely low activity of methionine synthase in vitamin B12 - deficient rats may by related of effects on coenzyme stabilization rather than to changes in coenzyme induction.// J. Nutr. -2000. 130. -P.-1894-1900]. Композиція суміші солей наведена у табл.4 Таблиця 4 Склад сольової суміші Назва солі кількість(грами) Натрію хлорид 58,5 Калій фосфорнокислий однозаміщений 163,3 Магнію сульфат 24,1 Кальцію карбонат 160,2 Заліза сульфат 11,1 Калію йодит 0,322 Марганець сірчанокислий 1,87 Цинк сірчанокислий 0,23 Мідь сірчанокисла 0,2 Кобальт хлористий 0,01 Натрію фторид 0,2 Алюмокалієвий галун 0,047 Калію-хром сульфат 0,55 Натрію селеніт 0,01 Загальна кількість 420,639 Суміш вітамінів була складена відповідно до фізіологічних потреб [Экспериментальная витаминология (справочное руководство) Под редакцией Ю.М. Островского Минск, "Наука и Техника", 1979, 551с.]. Композиція суміші вітамінів наведена у табл.5 Таблиця 5 Склад суміші вітамінів (мг на 1 кг сухої дієти) Вітаміни Тіамін (В1) Піридоксин (B6) Фолат (В9) Кобаламін (В12) Рибофлавін (В2) Пантотенат (В5) Нікотинат (B3) Біотин (В8) Токоферол (Е) кількість(мг) 4,0 0 0 0 5,0 15,0 15,0 0,1 150,0 Філохінон (К) Ретинол (А) Кальціферол (D) 2.0 1,0 0,03 Заявлену композицію (табл.3) одержують змішуванням усіх компонентів згідно [Инструкция для приготовления основной диеты для крыс. Утверждена Институтом Питания АМН СССР 27.12.1952г. М, 1952, 8с.]. Процес приготування дієти складається з декількох етапів, а саме: 1. Відмивання казеїну та крохмалю від вітамінів. 2. Приготування сольової суміші. 3. Приготування суміші водорозчинних вітамінів. 4. Приготування суміші жиророзчинних вітамінів. 5. Змішування всіх складових частин дієти. 1. Для відмивання казеїну та крохмалю від вітамінів використовують рекомендації [Инструкция для приготовления основной диеты для крыс. Утверждена Институтом Питания АМН СССР 27.12.1952г. М., 1952, 8с.], а також [Экспериментальная витаминология (справочное руководство) Под редакцией Ю.М. Островского Минск, "Наука и Техника", 1979, 551с.] та [Jamada K. et al. Extremely low activity of methionine synthase in vitamin В12 deficient rats may by related of effects on coenzyme stabilization rather than to changes in coenzyme induction. //J. Nutr. -2000. -130. -P.-1894-1900]. 2. Для приготування сольової суміші, необхідні кількості кожної солі (табл.4), за виключенням калію йодиту, розтирають разом у ступці та ретельно зважують з частиною натрію хлориду. Калія йодит окремо розтирають у ступці та зважують із частиною натрію хлориду, яка залишилася (для попередження випадіння вільного йоду). Всю сольову суміш добре перемішують та доводять до борошноподібного стану шляхом просіювання через сито (40 вічок на 1см3). Потім сольову суміш додають до сухих продуктів дієти, які знову ретельно перемішують. 3. Водорозчинні вітаміни (В1, В2, B3, B5, В8, К) змішують з глюкозою з таким розрахунком, щоб в 1г суміші (0,1% від маси дієти) містилася їх необхідна доза (табл.5). Розчин вітамінів готують на цілий тиждень та зберігають у холодильнику. 4. Жиророзчинні вітаміни (A, D, Е) додають у відміряну кількість суміші соняшникової олії з лярдом, яку ретельно збовтують та виливають у вже зважені та ретельно змішані сухі інгредієнти дієти. Усе знову дуже ретельно перемішують. 5. На кінцевому етапі приготування дієти відмірюють дистильовану воду із розрахунку: 150мл води на 100г. сухих харчових інгредієнтів. Воду доводять до сильного кипіння, знімають з вогню та додають в неї водні розчини вітамінів. Потім у воду засипають суху частину корма, вже попередньо змішану із жировою сумішшю. Усе ретельно розмішують. Дієта вважається готовою для застосування. При проведенні експерименту по моделюванню ГГЦ рівень tHcy через 2 тижні перебування 25 лабораторних тварин (male Wistar rats) на цій дієті зростав в середньому у 11,6 рази, що відповідає важкому ступеню ГГЦ. Рівень tHcy визначали за відомим методом [Патент України №47645А, ΜKB7 А61В5/145. Спосіб визначення концентрації тіолів в біологічній рідині / О.В. Ільченко, О.О. Пентюк, В.Л.РОЗГОНЮК та інші //Бюлетень, -2002. №7 від 15.07].