Спосіб визначення токсичних або фармакотерапевтичних доз лікарських речовин

Винахід має відношення до фармації, а саме до способів визначення токсичних або фармакотерапевтичних доз лікарських речовин і може бути використаний під час проведення доклінічних і скринуючих досліджень лікарських речовин. Відомий спосіб визначення активності граміцидіну шляхом контактування бактеріальної суспензії (Photobacterium leiognathi) з антибіотиком з наступним оцінюванням його дії на тест-систему за ступенем падіння люмінесценції (а.с. СРСР №1255920, G01N33/15, С12Q1/02, 1/06, опубл. 07.09.86). Недоліком відомого способу є неможливість його застосування для визначення фармакотерапевтичних доз інших лікарських речовин. За прототип пропонованого винаходу обрано спосіб визначення токсичних або фармакотерапевтичних доз лікарських речовин шляхом проведення випробувань доз лікарських речовин на групі тест-систем з наступним оцінюванням дії речовин на тест-системи за показником виживання і порівнянням останнього з контролем (Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації. За редакцією член-кореспондента АМН України О.В. Стефанова, Київ, 2001р., с.85-95, 334-349). У відомому способі в якості тест-системи використовують експериментальних тварин (мишей, щурів, морських свинок, кроликів, собак тощо), при цьому для одержання достовірного результату використовують велику кількість тварин. Виживання останніх фіксують візуально. Результати випробувань опрацьовують математичним методом з використанням критерію Ст'юдента, будують криву залежності „доза-ефект" і по кривій визначають величини токсичних або фармакотерапевтичних доз лікарських речовин у мг/кг маси тварини. Однак дози лікарських речовин у зазначених вище одиницях, одержані під час здійснення відомого способу, не можуть бути використані для терапевтичного лікування людей. Для цього необхідно дози, одержані на тваринах, перерахувати з застосуванням відомих коефіцієнтів. Проте яким би способом або навіть декількома способами цей перерахунок не було б здійснено, він не буде абсолютно точним. В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу визначення токсичних або фармакотерапевтичних доз лікарських речовин шляхом використання нової тест-системи і нового методу визначення її виживання при діянні лікарської речовини таким чином, щоб забезпечити одержання величин доз, які не потребують подальшого перерахунку за допомогою відомих коефіцієнтів. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення токсичних або фармакотерапевтичних доз лікарських речовин шляхом проведення випробувань доз лікарських речовин на групі тест-систем з наступним оцінюванням дії речовин на тест-системи за показником виживання і порівнянням останнього з контролем, згідно з винаходом, в якості тест-системи використовують клітинні лінії на основі клітин людини, а виживання визначають шляхом введення в клітинну культуру спочатку 3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5-дифенілтетразолу броміду, а потім диметилсульфоксиду з наступним аналізом одержаних розчинів відомим спектрофотометричним методом за довжини хвилі, що дорівнює 550нм. При цьому для визначення токсичних доз лікарських речовин або доз гепатопротекторів в якості клітинної лінії на основі клітин людини використовують лінію HepG2 на основі клітин гепатоми людини. Сукупність суттєви х ознак пропонованого винаходу забезпечує одержання величин токсичних або фармакотерапевтичних доз лікарських речовин, які не потребують подальшого перерахунку за допомогою відомих коефіцієнтів, в результаті того, що на відміну від прототипу лікарська речовина впливає безпосередньо на клітини людини, які мають властивість сприймати акцептор водню, яким є 3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5дифенілтетразолу бромід, і перетворювати його у мітохондріях у формазанову сіль, яка розчиняється у диметилсульфоксиді. Це сприяє тому, що виживання клітин визначається більш точним фізико-хімічним методом. Спосіб здійснюється наступним чином. Випробування доз лікарських речовин проводять на групі клітинних ліній на основі клітин людини. Для цього клітини вирощують на живильному середовищі до досягнення субконфлуентного моношару, потім видаляється середовище культивування і додається нове середовище культивування з лікарською речовиною. Виживання клітин визначають шляхом введення у клітинну культур у спочатку 3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5дифенілтетразолу броміду, а потім диметилсульфоксиду з наступним аналізом одержаних розчинів відомим спектрофотометричним методом за довжини хвилі, що дорівнює 550нм. В якості живильного середовища використовують середовища ДМЕМ (каталог „Sigma", №D6655, 2003г., с.424), середовище Ігла ("Flow", Велика Британія) та ін. Спосіб ілюструється наступними конкретними прикладами, у котрих в якості клітинної лінії використовують лінію HepG2 на основі клітин гепато-ми людини як одну з найбільш чутливи х і доступних клітинних ліній. Приклад 1. Клітини лінії HepG2 у 0,2мл живильного середовища ДМЕМ розсіювали по чарунках 96-чарункового плоскодонного планшета, приблизно 20´103 клітин на чарунку. Планшет поміщали у СO2-інкубатор і проводили інкубування протягом 24 годин при стандартних умовах: температура 37°С, 95% О2 і 5% CO2. Після закінчення інкубації здійснювали заміну живильного середовища. У чарунки А-1 - Н-1 (1 гр упа) вносили по 0,2мл чистого живильного середовища (інтактна група). У решту чар унок вносили по 0,2мл живильного середовища, яке містило тетрациклін у таких концентраціях: - чарунки А-2 - Н-2 (2 гр упа) - 0,0078мкмоль на 1мл живильного середовища; - чарунки А-3 - Н-3 (3 гр упа) - 0,016мкмоль на 1мл живильного середовища; - чарунки А-4 - Н-4 (4 гр упа) - 0,031мкмоль на 1мл живильного середовища; - чарунки А-5 - Н-5 (5 гр упа) - 0,062мкмоль на 1мл живильного середовища; - чарунки А-6 - Н-6 (6 гр упа) - 0,104мкмоль на 1мл живильного середовища; - чарунки А-7 - Н-7 (7 гр упа) - 0,130мкмоль на 1 мл живильного середовища. Після заміни живильного середовища планшет поміщали в СО2-інкубатор і проводили інкубування протягом 24 годин при стандартних умовах. Після закінчення інкубації проводили оцінювання виживання клітин у культурі. Для цього додавали 3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5-дифенілтетразолу бромід у кількості 0,04мл на чарунку і проводили інкубування протягом 40 хвилин при стандартних умовах. Після закінчення інкубування з усіх чарунок видаляли середовище з 3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5-дифенілтетразолу бромідом, вносили диметилсульфоксид у кількості 0,2мл на чарунку, ретельно піпетували і потім здійснювали інкубування протягом 10 хвилин при стандартних умовах. Після закінчення інкубації планшет поміщали в спектрофотометр „Тесап" і проводили аналіз одержаних розчинів за довжини хвилі, що дорівнює 550нм. Одержані результати наведені в таблиці 1. Аналіз даних показав, що тетрациклін здійснював токсичну дію на клітини печінки навіть за найменшої його концентрації (0,0078мкмоль/мл). При вказаній концентрації виживання клітин достовірно зменшилось на 7,87% у порівнянні з контролем і становило 92,13%. Таблиця 1 Експери- Концентрація Поглинання при Виживання ментальні тетрацикліну, 550нм (M±m) клітин, % мкмоль/мл групи 1 2 3 4 1 група 0,991±0,930 100,0±3,39 (контроль) 2 група 0,0078 0,913±0,015p