Вакцинний штам “буча-хдзва” teschovirus suis, збудника ензоотичного енцефаломієліту свиней (тешенської хвороби)

Передбачуваний винахід належить до галузі ветеринарної вірусології, зокрема до штамів тешовірусів, що можуть бути використані для виготовлення вірусвакцин проти тешенської хвороби (ТХ) на підприємствах біологічної промисловості. Існують різноманітні штами збудника, проти ТХ: а) вірулентні, які використовуються для виготовлення інактивованих вакцин і проведення їхнього біотехнологічного контролю; атенуйовані, які використовуються для виготовлення вірусвакцин ("живих" віральних вакцин). Вірулентні штами, наприклад, "Навля-96" (патент РФ №2176520 від 27.01.2000, наданий 10.12.2001, "Бюллетень изобретений РФ", 2001, №34) або "Бузун-ХДЗВА" (патент України №56044 від 17.09.2002, наданий 15.04.2003, Бюл. №4, 2003р.) здатні при інтрацеребральному введенні забезпечити захворювання з ознаками ТХ у неімунних підсвинків 2-4 місячного віку. За технічним рішенням щодо їх застосування, а саме - за імунологічною відповідністю епізоотичне актуальним варіантам збудника ТХ, вони є близькими до застереженого об'єкту (див., наприклад, "Вакцина проти тешенської хвороби свиней інактивована культуральна емульгована" ТУУ 46.15.051-94). Недоліками зазначених штамів збудника ТХ, у контексті застереженого об'єкту, є їхня непридатність для застосування у якості вірусвакцин. Це пов'язано з тим, що ці віруси тривалий час можуть розмножуватися в організмі гризунів і виділятися звідти у довкілля в вірулентному для свиней стані. Адже ці штами збудника є гетерогенними, близькими до природніх варіантів збудника за біологічним розмаїттям, утвореними з клонів вірусу, що розмножуються не тільки в кишковику, але й в нирках, легенях гризунів, тощо, де, можливо, й проходить селекція нейровірулентних для свиней клонів вірусу ТХ. З цією особливістю збудника пов'язана біонебезпека від недоінактивації неклонованого вірусу ТХ у вакцинних чи діагностичних препаратах, виго товлених з нього. Відомо також про атенуйований штам ("культуральний мутант") "Tubingen", який отримано з природнього (біологічно гетерогенного) штаму "Konratice" шляхом атенуації через серійні пасажі в культурі клітин нирок свині (цит. за кн.: Сюрін В.Н., Фоміна Г.М. Частн. вет. вір., "Колос", 1979: с.367). За тою ж технологією отримано штам "Перечинський-642" (В.П. Романенко, О.Г. Прусс, ж. Ветеринарія, 1983, №..., с....), який може бути прототипом застереженого об'єкту. Прототипний штам при 3-х поспільних пасажах через морську свинку розмножується лише в кишковику гризуна і його титри не перевищують 2,5 lg ТЦД50/г кишковика ; фекалії. гризунів жодного з пасажних рівней вірусу "Перечинський-642" в морських свинках не утримують нейровірулентного для свиней вірусу (Буз ун A.I. Екологічні аспекти вакцинопрофілактики тешенської хвороби, друкується, 2003). Це свідчить про екологічну безпечність штаму "Перечинський-642". Проте недоліком прототипного штаму є те, що він імунологічно відрізняється від епізоотично актуального варіанту збудника ТХ, який наразі циркулює в нозоареалі ТХ, і це робить вакцинопрофілактику з його використанням малоефективною (Бузун А.И., Середа А.Д., Жестерев В.И. и др. Совершенствование вакцинопрофилактики болезни Тешена. Ветеринария, 2001, №12, с.19-21). В основу передбачуваного винаходу поставлено завдання одержання атенуйованого штаму вірусу ТХ свиней, який за протективним антигеном відповідав би епізоотично актуальним варіантам збудника ТХ свиней, але мав би обмежені можливості до розмноження в гризунах і, головне, при пасажуванні через гризуна (морську свинку) не перетворювався б у нейровірулентний для свиней агент. Це дозволило б створити біотехнологічні основи для виробництва сучасної ефективної вірусвакцини проти тешенської хвороби, яка б була екологічно безпечною, з одного боку, а з іншого - мала б високу рентабельність, притаманну всім вірусвакцинам у порівнянні з інактивованими вакцинами. Поставлена задача вирішується завдяки серійному пасажуванню польового вірусу ТХ (ізолят "Буча") в культуральних системах свинячого походження, а також через організм свині. Таке пасажування призводить, з одного боку, до селекції клонів вірусу ТХ з обмеженим репродукційним потенціалом для гризунів і, як наслідок, невірулентних для свиней, а з другого, - не торкається специфічності протективного антигену, тобто не змінює його імунологічної відповідності вихідному ("дикому") штаму "Буча", виділеному з мозку хворої на ТХ свині з сучасного ензоотичного вогнища на Харківщині. Згідно з результатами реакції нейтралізації визначено, що вірус "Буча-ХДЗВА" належить до тешовірусів свиней і не відрізняється від штаму "Буз ун-ХДЗВА" за індексом нейтралізації (Таблиця 1). В свою чергу, штам "Буз ун-ХДЗВА" не відрізняється за протективним антигеном від штаму "Навля-96" і інших сучасних епізоотичних варіантів збудника ТХ (Буз ун А.Й., Середа А.Д., Жестерев В.И. и др. Совершенствование вакцинопрофилактики болезни Тешена. Ветеринария, 2001, №12, с.19-21). Таблиця 1 Визначення імунологічної спорідненості штаму "Буча-ХДЗВА" зі штамами "Буз ун-ХДЗВА" і "Перечинський-642" збудника тешенської хвороби за індексом нейтралізації (ІН) № досліду 1 2 3 Схема постановки досліду Шт. Буз ун-ХДЗВА Шт. Буз ун-ХДЗВА+СС до шт. Бузун-ХДЗВА Шт. Буча-ХДЗВА Шт.Буча-ХДЗВА+СС до шт. Буз ун-ХДЗВА Шт. Буз ун-ХДЗВА Шт. Буз ун-ХДЗВА+СС до шт. Буча-ХДЗВА Шт. Буча-ХДЗВА Шт.Буча-ХДЗВА+СС до шт. Буча-ХДЗВА Шт. Перечинський-642 Шт. Перечинський-642+СС до шт. Перечинський-642 Шт. Буча-ХДЗВА Титр вірусу (lg ТЦД50/мл) 4,75 0 7,5 0 4,75 0 7,5 0 8,0 0 7,5 ІН (в%) 100 100 100 100 100 4 Шт.Буча- ХДЗВА+СС до шт. Перечинський-642 Шт. Перечинський-642 Шт. Перечинський-642+СС до шт. Буча-ХДЗВА Шт. Буча- ХДЗВА Шт.Буча- ХДЗВА+СС до шт. Буча-ХДЗВА 2,5 8,0 2,5 7,5 0 66,7 68,8 100 Зауваження: СС- сироватка морської свинки специфічна до відповідного вірусу, взята в дослід в дозі 20 нейтралізуючих одиниць (Романенко В.П., Прус О.Г. Ретроспективний аналіз сироваток крові як метод діагностики ентеровірусних захворювань свиней. "Мікробіол. Ж.", 1973, 35, "3, 401-402); Шт.- штам. В якості штаму "Перечинський-642" використовували відповідну вір усвакцину на рівні 3-4 пасажів в культурі клітин РК-15. В той же час результати перехресного титрування також наглядно свідчать про неповну двобічну відповідність (на рівні 60-70%) Штамів "Буча-ХДЗВА" та "Перечинський-642". Штам "Буча-ХДЗВА" було адаптовано до організму свиней та культур клітин, що походять від цього виду тварин, багаторазово клоновано ("очищено" до гомогенного стану) методом граничних розведень в культурі клітин РК-15; після серійного пасажування (52 пасажі при температурах 35-40°С) в перещеплюваних клітинах СПЕВ, ПТП, РК-15 (лабораторні лінії клітин нирок та тестесів поросят, відповідно) цитопатична активність штаму на рівні 48-52 пасажів оцінена в пробірочних культура х-клітин перещеплюваної лінії РК-15. Екологічна безпечність штаму на рівнях 50-52го пасажів досліджена шляхом його інтрацеребрального введення підсвинкам 3-місячного віку. Крім того, інтактні підсвинки цього ж віку експонувалися протягом 3 тижнів з морськими свинками, зараженими цим вірусом, взятим на рівні 52 пасажу в культурі клітин. Крім того, таких же підсвинків інокулювали інтраперітонеально цим же вірусом, але додатково пасажованим 2 рази поспіль через кишковик морської свинки, як це відпрацьовано для вірусу "Бузун-ХДЗВА" (патент України №56044 від 17.09.2002). Результати зазначених досліджень засвідчили його високу репродуктивну активність в культурах клітин, екологічну безпечність, імуногенність для свині і дозволяють характеризувати штам "Буча-ХДЗВА" наступними ознаками. Таксономічна характеристика Вірус є стійким до розчинників жирів (хлороформу, фреону, тощо). При електронній мікроскопії має форму та розміри, типові для ентеровірусів. В реакціях нейтралізації та імуноферментного аналізу визначається наявність антигенів, загальних для всіх ентеровірусів свиней 1-го серотипу. Таблиця 2 МАРКЕРНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАМУ "БУЧА-ХДЗВА "Вірус репродукується в культуральній системі первинних (ПС) та перещеплюваних клітин свині (СПЕВ, РК-15, ПТП) при оптимальній температурі (37,5±0,5°С) до інфекційних титрів 6,0-9,0 lg ТЦД 50/мл. Штам Адаптаційні властивості та кволо розмножується в шлунково-кишковому тракті (до титр у 2,5 lg контагіозність ТЦД50/г), але не в паренхіматозних органах щурів, мишей, морських свинок; активно розмножується в організмі свиней (до титру 5,5 lg ТЦД50/г кишковика). Вірус не патогенний для свиней при інтрацеребральному, внутрішньом'язовому, підшкірному та інтраперітонеальному способах Патогенні та нейровірулентні зараження, проте визиває у ни х короткотермінову віремию та властивості персистенцію вірусу. Гризуни не посилюють нейровірулентні властивості вір усу для свиней. При інтрамускулярному, інтравенозному, перректальному, інтраперітонеальному та пероральному введенні неімунним щодо тешенської хвороби свиням віком старше 1,5 місяців вірус визиває у них утворення віруснейтралізуючих антитіл в титрі 1/4-1/512. За Властивості корисної речовини, результатами РН вірус є імунологічно спорідненим сучасним що виробляється вірусом епізоотичним варіантам збудника ТХ і сутттєво (на 35-40%) відрізняється від штамів збудника, отриманих з епізоотичних варіантів 50-70-х років ізоляції. Це робить вірус придатним для розробки сучасних вірусвакцин проти ТХ. Не агглютинує еритроцити миші, морської свинки, свині, курей та качок Властивості аглютинації без додаткової обробки. Повністю втрачає інфекційні властивості після прогріву протягом 2 Терморезистентність (Т56- ознака) годин при 56°С, але частково зберігає антигенну активність. Хлороформ, ефір, фреон та інші жиророзчинники не пригнічують інфекційної активності вірусу. Вірус є чутливим до антитіл проти гетерологічних ентеровірусів свиней, до термолабільних ?-інгібиторам Інгібиторочутливість нативних сироваток великої рогатої худоби та свиней. Вірус інактивують розчини формальдегиду, сірчанокислої міді, теотропину, уротропину, кристал-віолету в різних концентраціях. Стабільність генетичних та Стабільність генетичних та імунобіологічних ознак зберігалась за умов імунобіологічних ознак пасажування протягом 52 пасажів в культурі клітин СПЕВ, РК-15, ПТП (термін спостереження). Контамінація бактеріями, грибами, Не контамінований бактеріями, грибами, мікоплазмами та сторонніми мікоплазмами та сторонніми вірусами вірусами Стандартні умови вирощування Перещеплювані культури клітин нирки свині (виробнича лінія РК-15), вирощені в матрасах, пробірках, планшетах або ролерним способом в бутлях зі скла чи пластика, інокулюють вірусом те шенської хвороби штам "Буча-ХДЗВА" та інкубують при 37°C до повного розвитку цитопатичної дії (ЦПД), тобто до повної деструкції моношару клітин у вигляді закруглення та об'єднання уражених клітин в грони, з наступним відшаруванням у культуральну рідину. При множині зараження (М) 0,001 ТЦД50/г клітину ЦПД развивається через 96 годин інкубації в стаціонарних умовах і, приблизно через 72 години при ролерному культивуванні. При збільшенні М до 0,01 ТЦД50/г клітину ЦПД наступає через 48, а при М 0,1 ТЦД50/г клітину - через 24 години. Перед висушуванням штамм стабілізують пасажуванням через організм свині. Для цього клінічно здорового підсвинка, серонегативного щодо нейтралізуючих антитіл до ентеро- та коронавірусів свиней, пестівірусів жуйних та свиней, інтраперитонеально заражують культуральним вірусом не більше як 52 пасажу в культурі клітин. Через 10-12 діб після цього, з дотриманням необхідних правил, від інокульованого підсвинка (після евтаназії) відбирають по 3-5г слизових оболонок голодної, ободочної та прямої кишок. З цього біоматеріалу готують 30-50% суспензію. Отриману суспензію протягом 10-12 годин оброблюють хлороформом у співвідношенні 1:10, антибіотиками і надосад змішують зі знежиреним молоком або іншими стабілізаторами ліофілізують в ампулах чи флаконах, та зберігають при температурі не вище 6°С. Цей вірус є вихідним для наступного пасажування в культурах клітин свинячого походження, але не більше 20 пасажів поспіль. Після цього вірус знову пасажують через організм свині зазначеним вище способом. Штам "Буча-ХДЗВА" Enterovirus suis збудника ензоотичного енцефаломієліту свиней (тешенської хвороби) наразі використовується в академії, як виробничий для розробки та виготовлення лабораторноекспериментальних серій вірусвакцини проти тешенської хвороби. Приклад 1 Застосування штаму для інтрамускулярної імунізації підсвинків Підсвинкам (n=2 і більше) віком старше 2 місяців у м'язи шиї вводять 2,5-3,5 lg ТЦД50 вірусу "Буча ХДЗВА" 1552го пасажного рівня в культурі клітин (після освіження на підсвинку). Через 21 день після інокуляції їх, а також двох невакцинованих підсвинків інтраперитонеально заражають вірусом штаму "Бузун-ХДЗВА" в дозі 100 ЛД50. Підсвинків спостерігають протягом місяця. Починаючи з 6 доби після зараження вірусом "Бузун-ХДЗВА" підсвинки, необроблені вірусом "Буча-ХДЗВА", захворюють на тешенську хворобу і гинуть від неї на 12-30 добу після зараження. Титр віруснейтралізуюючих антитіл у підсвинків через 21 добу - 3 місяці після одноразової інтрамускулярної інокуляції 3,0-3,5 lg ТЦД50/підсвинка вір усу "Буча ХДЗВА" становить 1/32-1/256. Приклад 2 Застосування штаму для перректальної імунізації підсвинків Підсвинкам (n=2 і більше) віком старше 2 місяців у порожню ампулу прямої кишки вводять 3,5-5,0 lg ТЦД50 вірусу "БучаХДЗВА" 15-52го пасажного рівня в культурі клітин (після освіження на підсвинку). Через 21 день після інокуляції їх, а також двох невакцинованих підсвинків інтраперитонеально заражають вірусом штаму "Буз унХДЗВА" в дозі 100 ЛД50. Підсвинків спостерігають протягом місяця. Починаючи з 6 доби після зараження вірусом "Буз ун-ХДЗВА" підсвинки, необроблені вірусом "Буча-ХДЗВА", захворюють на тешенську хворобу і гин уть від неї на 12 -30 добу після зараження. Титр віруснейтралізуюючих антитіл крові у підсвинків через 21 добу після одноразової перректальної інокуляції 4,0-5,0 lg ТЦД50/підсвинка вірусу "Буча-ХДЗВА" становить 1/8-1/128. Через 21 добу після такої інокуляції підсвинків титр копроантитіл до тешовірусів в реакції нейтралізації становить 1/4-1/16. Приклад 3 Перевірка екологічної безпеки штаму "Буча-ХДЗВА" Морських свинок (n=2 і більше) інокулюють вірусом штаму "Буча-ХДЗВА" інтраперитонеально в дозі 7,5 lg ТЦД50 . Через 1 тиждень після цього їх підсаджують (в клітці з рабиці) над 1-2-масеронегативними щодо тешовірусів підсвинками віком 2,5-3 місяці з таким розрахунком, щоб послід від гризунів попадав у годівниці свиням. Підсвинків спостерігають протягом місяця. Протягом зазначеного терміну підсвинки ознак тешенської хвороби не проявляють і антитіл до тешовірусів у них не утворюється. В той же час, ці підсвинки зберігають чутливість до інтраперітонеального зараження тешовірусом-пробійником "Бузун-ХДЗВА". Приклад 4 Перевірка нейровірулентності штаму "Буча-ХДЗВА" Серонегативних щодо тешовірусів підсвинків (n=2 і більше) віком старше 2,5-3 місяці інтрацеребрально інокулюють вірусом штаму "Буча-ХДЗВА" в дозі 6,5-7,0 lg ТЦД50. Підсвинків спостерігають протягом місяця. Клінічний стан їх не змінюється протягом всього періоду нагляду. Після такої обробки підсвинки втрачають чутливість до зараження вірусом-пробійником "Бузун-ХДЗВА", взятим в дозі 100 ЛД50.