Трансплантат, що усуває дефекти та відновлює функції біологічних тканин, та спосіб його одержання

Винахід відноситься до біоактивних полімерних матеріалів і до способів їх одержання та може бути використаний в галузі медицини, коли необхідне усунення дефектів тканин, наприклад, в косметології для контурної пластики м'яких тканин обличчя, або для корекції глибоких зморшок та інш., в пластичній та реконструктивно-відновлюючій хірургії для поповнення об'єму тканин та моделювання структури тканини, що функціонує повноцінно, в "клітковій терапії" для трансплантації ембріональних клітин, які необхідні для відновлення функції тканин та органів. Живі ембріональні клітини, введені в організм людини, здатні приживлятися і компенсувати функціональну недостатність або забезпечувати репарацію власних тканин та органів людини. Останнім часом використання ембріональних клітин набуло перспективного характеру завдяки їх високій проліферативній здатності, наявності ембріоноспецифічних ростових факторів, цитокінів та інших сигнальних механізмів, здатних стимулювати обмінні процеси в клітинах реціпієнта. Але терапевтичний ефект трансплантації ембріональних клітин в дорослий організм характеризується відносно коротким часом, що не перевищує 3-6 місяців. Це пов'язано з тим, що ембріональні клітини мають власний генотип, який проявляється по мірі диференцировки і, в кінцевому рахунку, приводить до відторгнення введених клітин. Запобігання відторгнення клітин звичайно досягають шляхом постійного прийому реципієнтом імунодепресантів, але ці заходи не забезпечують в необхідній мірі імунний захист клітин. Крім того, тривале введення імунодепресантів може призвести до виникнення небажаних побічних ефектів та ускладнень. Задачею цього винаходу є створення трансплантату, що усуває де фекти та функції біологічної тканини, шляхом підбору такої сукупності його компонентів, яка забезпечує максимальний лікувальний ефект. Поставлена задача вирішується тим, що трансплантат, що усуває дефекти та відновлює функції біологічних тканин, згідно з винаходом, містить поліакриламід-ний гідрогель та суспензію ембріональних клітин 6-7 тижневої гестації людини з концентрацією від 2,5.105 до 2,5.107кл/мл при співвідношенні поліакриламідний гідрогель : суспензія, що складає 1:(1-3), причому поліакриламідний гідрогель має комплекс властивостей, що визначають його біосумісність з ембріональними клітинами. Крім того, сукупність ознак, що запропонована авторами цього винаходу, які характеризують трансплантат, передбачає додаткове введення в поліакриламідний гідрогель цільових добавок, які підсилюють необхідні фізикомеханічні та фізико-хімічні властивості трансплантату, зокрема біосумісність трансплантату з біотканиною. А передбачене додаткове введення, наприклад, антибіотиків надає трансплантату, що одержують, більш високий ступінь гарантії стерильності. Як було вказано вище, введення в організм людини ембріональних клітин є досить обгрунтованим та корисним, але існує ряд недоліків, які створюють серйозні перепони для широкого використання такого лікування. Авторами винаходу для імуноізоляції ембріональних клітин був використаний поліакриламідний гідрогель, одержання якого описано в патенті України № 64849. Суспензія ембріональних клітин була сполучена з поліакриламідним гідро-гелем, що дозволило забезпечити імунологічний захист і повноцінне функціонування таких клітин. Зокрема, фагоциди, що здатні поглинати ембріональні клітини як інорідні тіла, блокуються гідрогелем і нема необхідності знищува ти їх за допомогою депресантів. Попередньо були проведені досліди на лабораторних щурах, які показали, що ембріональні клітини, сполучені з гідрогелем, у разі підшкірного або внутрішньом'язового введення зберігали життєздатність та утворювали колонієподібні структури. Результатом використання такого трансплантату з'явилась відсутність через 2-4 тижня після його введення ознак запалення, відторгнення та лімфатичної інфільтрації. Що стосується вимог до властивостей поліакриламідного гідрогелю, то вони повинні бути такими, щоб забезпечити найбільшу біосумісність з ембріональними клітинами при введенні трансплантату в організм людини. Трансплантат повинен зберігати життєздатність і виконувати призначену йому функцію, для цього ембріональні клітини повинні одержувати ззовні необхідні речовини а також вільно вивільняти за межи трансплантату секретуємі біологічно активні речовини. Цім цілям відповідає вибраний авторами поліакриламідний гідрогель, в який іммобілізовані ембріональні клітини. Вказаний гідрогель забезпечує мікрокапсуляцію клітинного трансплантату і подальшу вільну його імплантацію в потрібну область організму людини в залежності від поставленої мети. Завдяки властивостям гідрогелю та його просторової структури ембріональні клітини активно фіксуються в ньому, зберігають високу життєздатність, виникає інтенсивний ріст колоній, утворюються міжклітинні синоптичні зв'язки. Властивості поліакриламідного гідрогелю, який відповідає цій вимозі, представляють собою комплекс фізикомеханічних і фізико-хімічних характеристик, таких як: водовміст, динамічна в'язкість, міцність при проколі, відносне подовження, показник переломлення, ступінь набухання, світлопропускання, рН, швидкість переносу вологи, коефіцієнт переносу іонів Na+, K+, Са+ коефіцієнт переносу кисню і пористість. Визначаючими властивостями поліакриламідного гідрогелю є, в першу чергу, водовміст, динамічна в'язкість, рН, коефіцієнт переносу іонів, коефіцієнт переносу О2 , пористість. Вибір комплексу вказаних характеристик та їх кількісне значення визначається необхідним клітинним складом. Клітинний склад трансплантату підбирають індивідуально для кожного хворого в залежності від необхідності відновлення або компенсації порушеної функції органів або тканин. Основною вимогою, що пред'являють до якості суспензії ембріональних клітин, є їх колонієутворююча активність, яка, в першу чергу, залежить від термінів гестації ембріона людини. Так, зокрема, на прикладі клітин ембріональної печінки було доказано, що колонієутворюча активність клітин 6-7 тижнів гестації перевищує більше, ніж втричі активність клітин, одержаних від ембріонів 9-12 тижнів. Відповідні залежності були виявлені і для інших різновидностей клітин Клітини ранніх термінів гестації, а точніше 6-7 тижневі, що введені в організм людини у вигляді суспензій, приживляються в ньому, зберігають здатність до репопуляції, практично не мають імуногенних властивостей, не відторгаються і не викликають реакції "трансплантат проти хазяїна". Як було доказано авторами цього винаходу, поєднання поліакриламідного гідрогелю та ембріональних клітин вказаної гестації стало вирішенням проблеми попередження відторгнення клітин, розпізнавання їх імунною системою рецепієнта. Значна роль при створенні трансплантату, що заявляється, відводиться співвідношенню поліакриламідного гідрогелю і суспензії ембріональних клітин, яке складає 1:(1-3), саме при такому співвідношенні спостерігається найбільш висока життєздатність клітин. Крім того, при вказаному співвідношенні вдається найбільш рівномірно змішувати кліткову суспензію з гідрогелем, кріоконсервувати та ін'єкційно вводити одержаний трансплантат в організм хворого. Концентрація ембріональних клітин в суспензії визначена на основі життєздатності і активності імобілізованих клітин і дорівнює 2,5.105-2,5 .107 кл/мл. При концентрації нижче вказаної нижньої межі існує велика вірогідність, що колонії не будуть утворюватись в необхідній кількості, що призведе до втрати лікувального ефекту трансплантата. При збільшенні концентрації клітин більше 2,5.107 кл/мл спостерігається їх загибель в результаті конкуренції і пригнічення росту клітин, що також призводить до негативного лікувального результату. Крім того, авторами передбачена можливість використання поліакриламідного гідрогелю, попередньо модифікованого цільовими добавками, що забезпечують трансплантату додаткові фізико-механічні та фізико-хімічні властивості, а також властивості, що підсилюють його біосумісність з тканинами організму і забезпечують стерильність. Таким чином склад трансплантату, що пропонується, для усунення дефектів і відновлення функцій органів не призводить до відторгнення клітин. Клітини приживляються, проліферують, що є передумовою продукції ними біологічно активних сполук, призводящих до нормалізації метаболічних і активації репаративних процесів в пошкоджених тканинах. Ще одною задачею цього винаходу є створення способу одержання трансплантату для відновлення дефектів і функцій біотканини шляхом сукупності певних дій та режимів, що дозволяють забезпечити трансплантату високу лікувальну дію. Поставлена задача вирішується тим, що в способі одержання трансплантату, що відновлює дефекти біологічних тканин, згідно з винаходом, стерилізований поліакриламідний гідрогель змішують з суспензією ембріональних клітин 67 тижневої гестації ембріона людини з їх концентрацією в суспензії від 2,5.105 до 2,5.107 в 1 мл при об'ємному співвідношенні поліакриалмідний гідрогель : суспензія 1-(1-3), причому поліакриламідний гідрогель має комплекс властивостей, що визначає його біосумісність з ембріональними клітинами, після чого одержану суміш витримують до досягнення максимальної іммобілізації клітин в поліакриламідному гідрогелі. В основі способу, що заявляється, лежить змішування поліакриламідного гідрогелю з суспензією ембріональних клітин, при цьому обгрунтування вимог до цих дво х компонентів трансплантата детально викладені вище. Умови наступного витримування одержаної суміші залежить від клітинного складу, необхідного для рішення конкретної задачі по усуненню дефектів або відновленню функцій біотканини. Але основною умовою при здійсненні способу трансплантату, що заявляється, є максимальний ступінь іммобілізації ембріональних клітин в поліакриламідний гідрогель. Максимальний ступінь іммобілізації клітин досягається за допомогою інтервалу температур від 4 °С до 37 °С і часу витримування суміші, який коливається від 30 хвил до 12 -24 годин. Від реалізації вказаних умов здійснення способу залежить також ступінь рівномірності розподілення і закріплення клітин в структурі гідро-гелю а також утворення первинної клітинної популяції, що, в свою чергу, є визначаючим фактором для лікувальної дії трансплантата. Після виконання всієї сук упності дій способу, що заявляється, одержаний трансплантат готовий для використання. Але трансплантат часто треба зберігати тривалий час, протягом якого його активність різко падає. Щоби уникнути такого ускладнення, одержаний продукт піддають додатковим операціям. Перед змішуванням з гідрогелем до суспензії ембріональних клітин додають 5-10 % ДМСО (диметилсульфоксид) і потім після витримування суміш при вказаних вище умовах її о холоджують при швидкості 1 °С/хвил до - 40 °С, потім зі швидкістю 5 °С/хвил до - 70 °С. Трансплантат готовий для тривалого зберігання. Такий режим приготування трансплантату дозволяє зберегти структур у гелю, а також забезпечити необхідну життєздатність іммобілізованих ембріональних клітин. Приклад 1 Стерилізований поліакриламід ний гідрогель був одержаний відповідно до патенту України № 64848. Характеристики гідрогелю наступні: вміст води 97,0 % динамічна в'язкість 7970,0 спз РН 7,2 пористість 1000Å коефіцієнт переносу іонів Na+ 7,7.10-6 + К 11,0.10-6 Са+2 7,0.10-6 . -10 О2 10,3 10 мл см/см 2 сек мм Hg Для одержання трансплантату була використана суспензія ембріональних нейрональних клітин 6-тижневої гестації, причому концентрація клітин в суспензії складала 2,5.105 кл/мл. Об'ємне співвідношення гідрогелю і суспензії складало 1 : 1. Після змішування гідрогелю і суспензії у вібраційному міксері суміш витримують протягом 30 хвил при температурі 4 °С. При вказаних умовах була досягнута максимальна рівномірна іммобілізація ембріональних клітин. Після наведених дій одержали трансплантат, придатний до використання. Приклад 2 Попередньо до суспензії ембріональних клітин печінки 7 - тижневої гестації з концентрацією 2,5.106 кл/мл додають 5 % диметилсульфоксида. Одержану суспензію клітин змішують з гідрогелем, причому співвідношення гідрогелю і суспензії складало 1:2. змішування компонентів здійснюють в вібраційному міксері, після чого суміш витримують протягом 20 годин при температурі 35 °С - 37 °С в СО - інкубаторі. Вказаний режим потрібен для рівномірного розподілення і максимального закріплення клітин в стр уктурі гідрогелю, а також для утворення первинної клітинної популяції. Контейнер з одержаною сумішшю поміщають в пари рідкого азоту і поступово охолоджують зі швидкістю 1 °С/хвил до - 40 °С, потім охолодження продовжують зі швидкістю 5 °С/хвил до - 70 °С. Після цього контейнер поміщають в дюар для тривалого зберігання. Такий режим дозволяє зберегти структур у гелю а також забезпечити високий показник життєздатності іммобілізованих клітин (65 -70 %). Приклад 3 Пацієнтка М., вік 35 років. Клінічний діагноз: атрофія м'яких тканин обличчя. Страждає даним захворюванням 11 років. Консервативна терапія і фізиотерпія, що були неодноразово проведені, відчутних результатів не дали. Під місцевою анестезією ін'єкційне введено 16мг одержаного на основі поліакриламідного гідрогелю з іммобілізованими гемопоетичними та нейрональними клітинами трансплантанту. Хоча на 2-3 добу з'явилась незначна пастозність тканин обличчя в місцях уведення препарату, починаючи з 7-10 доби вона повністю зникла, шкіра набула рожевого відтінку, відзначили її потеплення, зникли дрібні зморшки, значно підвищилась еластичність м'яких тканин, що свідчить про посилення регіональної мікроциркуляції, про активізацію трофіки тканин та підвищення їх тонусу. Час спостереження за результатами лікування склав 1 рік, за цей час досягнутий стійкий косметичний ефект. Приклад 4 Для експерименту було відібрано 100 білих безпородних щурів вагою 150-200г. Для моделювання гострого токсичного ураження печінки піддослідним тваринам внутришньом'язово ввели 40 % CCl4 із розрахунку 0,5 мг/100 г ваги тварини, що викликало загибель 48 щурів з 50 контрольної групи протягом 7 днів. Ще 50 тваринам через ін'єкційну голку G-16 під капсулу печінки ввели біогель на основі поліакриламіда з іммобілізованими клітинами ембріональної печінки, контрольній групі - 50 тваринам був введений біогель без клітин. Трансплантат, що вводили, характеризується наступними показниками концентрація клітин в суспензії: 1,0.103-1,0 .106 кл/мл; співвідношення гідрогелю і суспензії: 1:3 добавки, наприклад, ламінін (фактор прикріплення): 0,03 % вміст води: 98,5 % динамічна в'язкість: 1 570,0 спз рН: 7,0 пористість: 1 000Å коефіцієнт переносу іонів Na+ 9,3.10-6 + К 12,0.10-6 Са+2 7,2.10-6 . -10 О2 10,3 10 мл см/см 2 сек мм Hg. Через два тижні після трансплантації морфологічне наслідування трансплантатів експериментальної групи щурів показало, що клітини ембріональної печінки утворюють в пдрогелі лобуло-подібні кластери гепатоцитоподібних клітин. Поглинання цими клітинами індоціаніна зеленого, який використовується в клінічній практиці як тест для оцінки функції печінки, є доказом того, що ці клітини є гепатоцити. Через два тижні після трансплантації морфологія клітин не змінилась, вони заповнили більшу частини об'єму гідрогелю. Одержані результати показують, що іммобілізовані в гель клітини при трансплантації не відторгаються імунною системою щурів, іммобілізовані клітини проліферують і диференціюються в гепатоцитарному напрямку і здатні виконувати детоксикаційну функцію, характерну для клітин печінки, що забезпечило 100 % виживаємість щурів після гострого токсичного ураження печінки. Таким чином винахід, що заявляється, дозволяє забезпечити приживляємість, проліферацію і диференцировку ембріональних клітин людини при вирішенні проблем, пов'язаних з трансплантацією, зокрема, косметології, травматології, реконструктивно-відновлюючею хірургією та ін. При використанні трансплантату, що пропонуються, у всі х випадках, що досліджувались, спостерігається позитивний клінічний ефект, що дозволяє вважати його перспективним для широкого впровадження в практичну медицину.