Спосіб приготування антимікробного препарату

Винахід належить до сільського господарства, медицини, ветеринарії, зооінженерії, може бути використаний для профілактики та захисту кормів і продуктів харчування від пошкодження їх бактеріальною флорою, токсичними плісеневими грибами і дріжджами - збудниками бактеріозів, мікозів та мікотоксикозів. Відомий спосіб приготування антибактеріального препарату на основі оману (Inula sp.), який включає настоювання висушеної подрібненої сировини (надземної частини, коренів та кореневищ ) оману клейкого (Inula viscosa) в дистильованій воді або етиловому спирті з подальшим фільтруванням і випарюванням з допомогою ротаційного випарювача, причому готовий препарат підлягає зберіганню у щільно закритих скляних пляшках у морозильній камері при температурі -20°С (Ali-Shtayeh M.S.,Yaghmour R.M-r.,Faidi Y.R.,Salem K.,Al-Nuri M.A. Antimicrobial activity of 20 plants used in folkloric medicine in the Palestinian area. Journal of Ethnopharmacology. 1998, 60, p.265-271). Недоліком відомого способу є недостатня антибіотична активність одержаного препарату по відношенню до ряду мікроорганізмів і його практична непридатність для реалізації в Україні, оскільки Inula viscosa є ендемічною рослиною, яка поширена лише на Близькому Сході і не зустрічається в середніх широтах. В основу запропонованого винаходу покладено завдання удосконалення способу приготування антимікробного препарату, в якому за рахунок настоювання висушеної подрібненої сировини оману високого (Inula helenium) в ацетоні або суміші ацетону з метиловим спиртом забезпечується підвищення фунгістатичної та антибактеріальної активності препарату по відношенню до мікроміцетів, золотистого стафілокока, ентеробактерій та аеробної спрорової мікрофлори і можливість одержання його в Україні на основі вітчизняної рослинної сировини. Поставлене винаходом завдання досягається тим, що у способі приготування антимікробного препарату який включає оброблення висушених подрібнених частин рослин з роду оман (Inula sp.) хімічними екстрагентами, настоювання, фільтрування і випаровування у вакуумі з допомогою ротаційного випарювача, згідно винаходу для екстрагування використовують кореневища і корені оману високого (Inula helenium), а в якості екстрагентів застосовують ацетон або суміш ацетону з метиловим спиртом з розрахунку 100-150мл екстрагента на 100г рослинної сировини. Приклад. Висушені кореневища і корені оману високого(Inula helenium) подрібнювали, заливали ацетоном або сумішшю ацетону з метиловим спиртом у співвідношенні 2:1 з розрахунку 100-200мл екстрагента на 100мл рослинної сировини, настоювали на протязі тижня у щільно закритих пляшках з темного скла при періодичному стр ушуванні і фільтрували крізь стерильний паперовий фільтр. Антибіотичну активність екстрактів перевіряли методом паперових дисків [Методы экспериментальной микологии. Справочник. /Под ред. В.Й.Билай. - К.: Наукова думка, 1982. - 550с. І], кожний диск діаметром 6 мм насичували одержаним екстрактом. Оброблені диски розміщували в ча шки Петрі на інокульовані агаризовані, оптимальні для росту тест - середовища: МП А - для культивування бактерій, сусло-агар - для гіфальних та дріжджеподібних грибів, середовище Сабуро для дріжджової мікрофлори, середовище Чапека - для гіфальних мікроміцетів. Посіви інкубували при температурі 37°С на протязі 24 годин для бактерій і дріжджів і 72-го дини (Т=28°С) для міцеліальних грибів. За контроль правили тест-культури з паперовими дисками, змоченими відповідними екстрагентами. Через зазначені вище проміжки часу визначали діаметр зон пригнічення росту бактерій, дріжджів та грибів. Дослідження на виявлення антибіотичної активності екстрактів коренів оману високого по відношенню культур патогенних бактерій та дріжджів Candida albicans показало, що ацетоновий та ацетоново-метиловий екстракти, виготовлені з розрахунку 100-150мл екстрагента на 100г рослинної сировини, істотно перевершували відомий препарат за рівнем антибіотичної активності відносно до золотистого стафілокока і виявили найвищу антикандідозну дію (табл.1). Крім того, запропонований препарат, на відміну від відомого, характеризувався антибіотичною активністю проби бактерії Pseudomonas azireginosa - збудника вторинних інфекцій у людини і тварини, ентериту в новонароджених, небезпечних захворювань домашньої птиці і хвороб ряду рослин, насамперед тютюну і салату. Дані, наведені в табл.1, свідчать що порівняно найсильнішу антибактеріальну і антикандідозну дію відмічали у ацетонового та ацетоново-метилового екстрактів коренів оману високого, узятих з розрахунку 100г на 100-150мл екстрагента. Подальше підвищення концентрації екстракту виявилося недоцільним через різке зменшення виходу готового препарату. У той же час випаровування відфільтрованого екстракту у вакуумі з допомогою ротаційного випаровувача веде до звільнення препарату від залишків хімічних екстрагентів і подальшого його концентрування без найменшої втрати антибіотичних властивостей. Екстракти, одержані при витраті 100г рослинної сировини на 200мл екстрагента, а також при екстрагуванні коренів оману високого метиловим спиртом, за рівнем антибактеріальної і антикандідозної активності практично не перевершували відомий препарат з сировини оману високого, що застосовується в медицині. Випробування ацетоново-метилового екстракту коренів оману високою на бактеріях, дріжджах і грибах (збудниках кишкових інфекцій, кандідомікозів та аспергиле-, пеніцило-, фузаріотоксикозів) показало, що запропонований препарат характеризується вираженою антибіотичною дією по відношенню до ряду мікроорганізмів (табл.2), виявив високу антибіотичну активність до кокової мікрофлори (Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus) бактерій кишкової групи-збудників ентеробактеріозів з проявами діареї (Е. Соїі, Salmonella sp. Proteus vulgaris, Pseudomonas aureginosa) мікобактерій, деяких спороутворюючих бактерій з роду Bacillus (В. subtilis, В. megaterium, В. mycoides, В. cerezis), фітопатогенних бактерій (Coryriebacterium michiganense), та міцеліальних грибів Penicillium sp. і Chaetomium comatum. Препарат проявив також істотну антикандидозну, антиаспергільозну і антифузаріозну активність та помітно пригнічував ріст Geotrichum candidum - збудника геотрихозів людини і сільськогосподарських рослин, особливо плодів цитрусових і томатів. Промислова придатність винаходу випливає з того, що запропонований спосіб одержання антимікробного препарату є недорогим, нескладним і цілком придатним для реалізації в Україні з використанням вітчизняної сировини, оскільки корені оману високого у широких масштабах заготовляються для медичних потреб, а одержуваний препарат має досить широкий спектр антимікробної дії, виявляє значну антибіотичну активність по відношенню до збудників особливо небезпечних інфекційних хвороб людини, тварини і сільськогосподарських рослин бактеріальної, грибної етіології та мікотоксикозів. Може зберігатися у щільно закритих пляшках з темного скла при кімнатній температурі на протязі року, не втрачаючи своїх антибіотичних властивостей. Таблиця 1 Антимікробна активність екстрактів оману в залежності від способу приготування Діамет э зони пригнічення росту, мм. Staphyloc Escherichi a Pseudomonasaureginosa Proteusvulgaris осе us coli aureus Препарат Ацетоновометиловий екстракт Inula gelenium (запропонований спосіб) 200мл\100г 150мл\100г 100мл\100г Ацетоновий екстракт Inula gelenium (запропонований спосіб) 200мл\100г 150мл\100г 100мл\100г Метиловий екстракт Inula gelenium 200мл\100г 150мл\100г 100мл\100г Ацетон+метиловий спирт (контроль) Ацетон (контроль) Метиловий спирт(контроль) Водний екстракт Inula viscosa (відомий спосіб) Спиртовий настій Inulaviscosa (відомий спосіб) Candidaalbicans 13,3 16,0 20,3 6,0 6,0 6,0 10,3 16,0 19,7 10,0 10.0 11,3 7.3 10.0 13,7 12,0 15,3 18.0 6,0 6,0 6.0 9,3 17,0 21,0 8,0 9.7 12.7 10,0 14,3 13,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6.0 6,0 6,0 6,0 7,0 8,3 9,0 6,0 8.3 8,0 9.0 10.0 8,7 10.0 11,3 6.0 6.0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 8,3 6,0 6,0 10,0 6,0 6,0 9,3 12,6 14,9 6,0 6,0 16,6 6.0 Таблиця 2 Антимікробна активність ацетоново-метилового екстракту оману високого Діаметр зони пригнічення росту, мм Ацетоново- метиловий Ацетон + метиловий Тест-культури екстракт (запропонований спирт(контроль) спосіб) Staphylococcus aureus Micrococcus luteus Escherichia coli Salmonella sp. Proteus vulgaris Pseudomonas aureginosa Serratia marcenses Mycobacterium В 5 Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus mycoides Bacillus cereus Corynebacterium michiganense Candida albicans Candida tropicalis Candida pseudotropicalis Saccharomyces cerevisiae Geotrichum candidum 16,0 46,0 6,0 14,3 10,0 16,0 6,0 46,3 6,0 6,7 36,3 46,7 26,3 10,0 12,3 6,0 12,0 18,3 6,0 10,0 6,0 6,0 10,0 6,0 6,0 10,0 6,0 12,0 6,0 6,0 6,0 6,0 9,7 6,0 12,0 6,0 Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus niger Penicillium crustosum Penicillium cyclopium Fusarium oxysporum Chaetomium comatum 14,7 16,3 16,0 22,0 47,0 10,0 48,0 6,0 10,0 9,7 6,0 12,3 6,0 6,0