Спосіб визначення цитотоксичної дії отрути блідої поганки

Винахід стосується біології і медицини, зокрема експериментальної і клінічної токсикології, і може бути застосованим для дослідження патогенезу інтоксикації при отруєнні блідою поганкою, так і оцінки ефективності лікувальних заходів. Відомий спосіб визначення цитотоксичної дії отрути блідої поганки, який включає інкубацію екстракту гриба блідої поганки і суспензії живих клітин як біологічного тест-об'єкту [1]. За відомим способом, з екстрактом токсину гриба блідої поганки на предметному склі інкубують одноклітинні організми, наприклад, інфузорії парамеції, а висновок про цитотоксичну дії отрути роблять за характером руху одноклітинних організмів у мікропрепараті та наступної деструкції клітин у ви гляді цитолізу. Недоліком відомого способу є недостатня інформативність, оскільки за анатомо-фізіологічними особливостями одноклітинні організми і клітини високоорганізованого багатоклітинного організму, зокрема вищих тварин і людини, в еволюційному плані відстоять надто далеко. З зазначених позицій рівень аргументованості висновків щодо токсичності отрути гриба, що досліджується, залишається недостатньо високим. В основу винаходу поставлене завдання вдосконалити відомий спосіб, в якому шляхом введення в діагностичну тест-систему додаткового інгредієнта інкубаційної суміші, спрямованого на розширення інформативності діагностичної реакції, зокрема щодо напрямку змін біоенергетичних процесів на рівні ізольованих клітин, досягають підвищення точності і інформативності способу. При розгляді технічного завдання було взято до уваги те, що токсини блідої поганки при поступленні в організм викликають комплекс цитотоксичних - структуральних і патохімічних змін на рівні клітин життєво важливих органів, наприклад, печінки і нирок, що водночас супроводжується суттєвими порушеннями метаболізму на рівні всього організму, ознаками якого вочевидь є згубні для організму вільнорадикальні процеси. Беручи до уваги наведене вище і актуальність розробки високоінформативних способів діагностики отруєння блідою поганкою на перший план виступає завдання якомога раннього визначення ступеню цитотоксичності токсинів блідої поганки. Цілком виправданим є пошук діагностичних проб на основі застосування адекватних біологічних тест-об'єктів, у тому числі на клітинному рівні. Такими є високодиференційовані багатофункціональні клітини крові, а саме - лейкоцити як клітини імунокомпетентної системи, і які є визначальними у мобілізації типових реакцій захисту і пошкодження, організму, зокрема тих, що супроводжуються збуренням вільнорадикальних процесів. З іншого боку, важливою є здатність препаратів антиоксидантної дії блокувати вищевказані вільні радикали: прояв їх дії в інкубаційній суміші в реакції діагностичної системи слугуватиме підтвердженням наявності токсину в дослідному субстраті. Виходячи з вищенаведеного, поставлене завдання вирішують тим, що у способі визначення цитотоксичної дії отрути блідої поганки, який включає інкубацію рівних об'ємів екстракту гриба блідої поганки і суспензії живих клітин як біологічного тест-об'єкту, відповідно до винаходу діагностичне дослідження ведуть одночасно в трьох препаратах - контрольному і двох дослідних, для чого на три окремих предметних скельця вміщують однаковий об'єм, наприклад, по 20-50мкл суспензії лейкоцитів лабораторної тварини, зокрема, білого щура, і до дослідних препаратів додають по аналогічному об'єму екстракту блідої поганки, а до одного з дослідних препаратів додатково вносять такий же об'єм 1% водного розчину препарату антиоксидантної дії тіотриазоліну, після чого до усі х препаратів на предметних скельцях додають розчин флюорохрому акридину оранжевого в розведенні 1:10000, покривають їх скельцями, витримують при 18-22°С впродовж 3-4год і спостерігають у полі зору люмінесцентного мікроскопу, а висновок про рівень цитотоксичної дії екстракту блідої поганки роблять за характером реакції лейкоцитолізу і рівнем люмінесценції клітин у мікропрепаратах. Перелік фігур креслень. Фіг.1 (мікрофото). Люмінесцентне світіння лейкоцитів периферійної крові інтактних щурів (контроль). Акридин оранжевий (АО) у розведенні 1:10000. Об. 30х ВИ; ок. х20К. Фіг.2 (мікрофото). Реакція цитолізу лейкоцитів периферійної крові щурів під впливом екстракту блідої поганки (дослід 1). АО 1:10000. Об. 30х ВИ; ок. х20К. Фіг.3 (мікрофото). Реакція цитолізу лейкоцитів периферійної крові щурів під впливом екстракту блідої поганки (дослід 1). АО 1:10000. Об. 9х; ок. 7х. Основний контроль. Фіг.4 (мікрофото). Характер люмінесценції лейкоцитів периферійної крові щурів під впливом екстракту блідої поганки при додаванні до інгредієнтів реакції препарату антиоксидантної дії тіотриазоліну (дослід 2). А01:10000.0б.9х; ок. 7х. Спосіб здійснюють таким чином. Готують контрольний і дослідні мікропрепарати, для чого на три окремих предметних скельця вміщують рівні об'єми, наприклад, по 20-50мкл, суспензії лейкоцитів лабораторної тварини, зокрема, білого щура, і до лейкоцитів у дво х дослідних препаратах вносять по аналогічному об'єму екстракту блідої поганки, а до одного з дослідних препаратів вносять такий же об'єм 1% водного розчину препарату антиоксидантної дії тіотриазоліну, після чого до усіх препаратів на предметних скельцях додають розчин флюорохрому акридину оранжевого в розведенні 1:10000, покривають їх скельцями, витримують при 18-22°С впродовж 3-4год і спостерігають у полі зору люмінесцентного мікроскопу, а висновок про рівень цитотоксичної дії екстракту блідої поганки роблять за характером реакції лейкоцитолізу і рівнем люмінесценції клітин у мікропрепаратах. Приклад 1 Готують контрольний і дослідні мікропрепарати, для чого на три окремих предметних скельця внесли по 50мкл суспензії лейкоцитів крові щура, і до нанесеної суспензії в двох дослідних препаратах додали по 50мкл екстракту блідої поганки, а до одного з дослідних препаратів внесли 50мкл 1% водного розчину тіотриазоліну, після чого до усіх препаратів на предметних скельцях внесли по 50мкл розчину флюорохрому акридину оранжевого в розведенні 1:10000, покрили їх скельцями, витримали при 20°С протягом 3год і спостерігали у полі зору люмінесцентного мікроскопу. Цитотоксичний вплив екстракту блідої поганки на ізольовані лейкоцити проявився різко вираженою деструкцією клітин у вигляді цитолізу і каріорексису. Так, якщо в контрольному мікропрепараті (фіг.1) ядра лейкоцитів, переважно круглої форми лімфоцитів, люмінесціювали монохромним зеленим світлом, то в результаті інкубації клітин з екстрактом блідої поганки в мікропрепаратах (фіг.2, 3) помітні грубо денатуровані клітини у вигляді розмитих плям з характерним тьмяним зеленим і червоним світінням - наслідки токсичного цитолізу. При додаванні до суміші лейкоцитів з токсичним екстрактом блідої поганки препарату тіотриазоліну спостерігали пікове зростання яскравості люмінесцентного світіння значної кількості клітин у мікропрепараті (до 35-40% клітин), що є свідченням блокування індукованого грибним екстрактом вільно-радикального процесу в ізольованих клітинах (фіг.4). Останнє пов'язане з тим, що надлишок біохімічної енергії, що вивільнився в результаті сповільнення метаболічних процесів у клітинах антиоксидантом, забезпечує посилення люмінесценції біосубстрату, а саме нуклеїнових кислот лейкоцитів. Саме на це вказує виражений мембранопротекторний ефект тіотриазоліну, який, як видно з мікрофото на фіг.4, виражається гальмуванням цитотоксичної - лейкоцитолітичної дії грибної отрути. Таким чином, лейкоцитоліз під впливом екстракту блідої поганки в І-му дослідному препараті в поєднанні з мембранопротекторним ефектом і піковим підвищенням яскравості люмінесценції клітинних ядер - у ІІ-му дослідному препараті є свідченням наявності в екстракті блідої поганки властивих цьому грибу токсичних чинників. Приклад 2 Лейкоцитотоксична дія екстракту блідої поганки у вигляді реакцій цитолізу і каріорексису за методикою вторинної (індукованої) люмінесценції виявлена при інкубації суспензії лейкоцитів, отриманих від різних тварин, зокрема, собаки, кролика, морської свинки, миші, кішки, голуба) і людини, що вказує на універсальний характер цитотоксичної дії грибних токсинів блідої поганки. Аналогічна універсальність щодо лейкоцитів периферійної крові у вигляді мембранопротекторного ефекту і здатності до пікового посилення люмінесцентного світіння субстратів клітинних ядер притаманна також іншим препаратам антиоксидантної дії, зокрема, глутаргіну і гістидинату міді. Отже запропонований спосіб забезпечує точніше та інформативніше, ніж за відомим способом-прототипом, визначення цитотоксичної дії токсину блідої поганки в екстракті, і може знайти застосування в клінічній та експериментальній токсикології. Джерела інформації, які слід взяти до уваги 1. Патент №30016 А, Україна. Спосіб визначення отруйності грибів /Бойчук Б.Р. /Заявка №97125878, 08.12.97. Опубл. 15.11.00. Бюл. №6-11.